SIRT1基因沉默對鼻咽癌CNE-1細胞放射敏感性的影響

肖 寧，李 彬，馮 勇，余曉旭，何 剛，馬志躍

鼻咽癌是由EB病毒感染誘發的頭頸部惡性腫瘤。中國是鼻咽癌的高發地區，約占全球總發病人數的40%。目前，臨床上針對鼻咽癌的治療措施主要是放療和化療。然而，由于鼻咽癌發病隱匿，大多數患者被確診時已進入晚期，放化療效果有限，導致預后差。因此，提高鼻咽癌放射敏感性，改善患者預后，成為當前腫瘤學領域亟待解決的問題之一。

沉默信息調節因子 2相關酶 1（sirtuin 1，SIRT1）是一種NAD依賴性去乙酰化酶，是sirtuins家族的重要成員之一，其作用涉及細胞代謝、細胞增殖分化、細胞周期調節和細胞凋亡等多個發育過程。SIRT1在鼻咽癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，且其表達水平與腫瘤的進程呈正相關。有研究報道，沉默SIRT1基因可抑制彌漫大B細胞淋巴瘤DLBCL細胞的增殖，并增加放療敏感性，也可促進肝癌細胞凋亡，但其對人鼻咽癌放射敏感性的影響還未見報道。因此，該研究擬運用RNA基因干擾技術沉默人鼻咽癌CNE-1細胞的SIRT1基因表達后，觀察其對細胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 標本與細胞 選取2018年1月1日—12月31日于四川省人民醫院行手術切除的20例鼻咽癌患者的鼻咽癌組織及其對應的癌旁組織，所有組織切除后迅速置于液氮，之后轉移至-80℃冰箱中保存，用于后期實驗檢測。所選的20例鼻咽癌患者標本均為鼻咽部活檢組織，經病理學檢查確診，組織學分型為非角化性未分化型鱗癌，所有鼻咽癌患者在術前均未接受任何治療。人鼻咽正常上皮細胞NP69和鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2、HNE-1和HNE-2購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。該研究經四川省人民醫院醫學倫理委員會批準，編號：倫審（研）2017-171。

1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清、MEM培養基（美國Hyclone公司）、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、總RNA提取試劑盒（上海碧云天生物公司）、PrimeScriptRT reagent Kit（日本Takara公司）、Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen公司）、SIRT1抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、Cleaved-Caspase3抗體和β-actin抗體（英國Abcam公司）。RT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 SIRT1-siRNA分子合成 根據siRNA設計原則，設計針對SIRT1基因的siRNA序列。SIRT1 siRNA序列：上游引物 5′-CCAAGCAGCUAAGAGUAA UTT-3′；下游引物 5′-AUUACUCUUAGCUGCUUGG TT-3′。對照組用 Negative control（NC-siRNA）經BLAST查詢，以上序列不與人類任何基因序列同源。核苷酸分子均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成有效siRNA干粉制劑。

1.4 細胞培養與轉染 將 NP69、CNE-1、CNE-2、HNE-1和HNE-2細胞培養于含10%胎牛血清的MEM培養基中，于37℃、5% CO條件下孵育，待細胞生長至對數期時，進行傳代或實驗。轉染前24 h將CNE-1細胞以1.5 ml／孔接種于6孔板（或75 μl／孔接種于96孔板），待細胞生長至50% ～60%匯合時轉染。轉染前細胞培養基更換為無抗培養基。以無血清和無雙抗的MEM培養基混懸siRNA（A液），以Opti-MEM混懸Lipo2000（B液），A液和B液混勻后加入6孔板。轉染6 h后即更換正常培養基繼續孵育。

1.5 Western blot實驗 收集細胞，提取各組細胞或癌組織總蛋白，BCA法對蛋白質進行定量，并用蛋白上樣緩沖液（5×）變性樣品，樣品于-20℃保存備用。使用等量蛋白質上樣，選擇10%的SDSPAGE進行分離，分離后的蛋白質轉移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，封閉結束后按照實驗目的結合一抗 （SIRT1、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3和β-actin均按1∶400稀釋），4℃孵育過夜后TBST清洗，然后根據一抗來源選擇合適的二抗（稀釋比例均為1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST清洗，ECL暗室顯色。顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統采集圖像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin為內參，計算各組細胞蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

1.6 RT-PCR實驗 收集細胞，使用總RNA提取試劑提取細胞RNA，并使用逆轉錄試劑盒Prime-ScriptRT reagent Kit進行逆轉錄，制備 cDNA，各cDNA樣品分別用下列引物進行PCR反應。STRT1上游引物：5′-CCAGAACATAGACACGCTGGAAC-3′，下 游 引 物：5′-CTCCTCGTACAGCTTCACAGTCA-3′；β-actin上游引物：5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′，下游引物：5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。反應體系為：PCR mix 6.25μl、上游引物 0.5μl、下游引物0.5μl、DEPC水4.25μl、cDNA 1μl，體系為12.5μl。反應條件為：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，40個循環。以β-actin mRNA水平作為內參。PCR結束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，凝膠成像系統掃描分析各條帶光密度值，以β-actin mRNA水平作為內參，計算各組mRNA相對表達水平。

1.7 CCK-8法檢測放射敏感性 細胞轉染6 h后，給予不同劑量 X射線（0、2、4、6、8 Gy）放射處理，繼續培養24 h后，吸棄原培養基，新鮮培養基與CCK-8按10∶1的比例混勻后每孔加入100μl，繼續孵育1 h后放于酶標儀上檢測（波長為450 nm）各孔吸光度（OD）值。

1.8 PI染色檢測細胞周期 細胞轉染6 h后，給予不同劑量 X射線（0、2、4、6、8 Gy）放射處理，繼續培養24 h后，收集細胞，經PBS洗滌和胰蛋白酶消化后離心，用70%的乙醇4℃固定過夜。加入RNAnase緩沖液37℃孵育30 min后，加入PI工作液（50 μg／ml），輕輕混勻后常溫避光染色30 min。在1 h內用流式細胞儀檢測DNA含量變化，實驗重復3次。

1.9 Annexin V／PI雙染及流式細胞術檢測細胞凋亡率 細胞轉染6 h后，給予不同劑量X射線（0、2、4、6、8 Gy）放射處理，繼續培養24 h后，收集細胞，經PBS洗滌和胰蛋白酶消化后用結合緩沖液（1×）輕輕重懸細胞至細胞密度為1×10／ml，吸取100μl的細胞懸液（約1×10個細胞）到1.5 ml離心管，加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，孵育結束后每管繼續加入400μl緩沖液，在1 h內上機檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織中STRT1蛋白的表達量 與癌旁組織比較，鼻咽癌組織中STRT1蛋白表達量升高，差異有統計學意義［（1.07±0.85）vs（1.24±0.14），F＝0.241，t＝-3.188，P＜0.05］，提示STRT1在鼻咽癌組織中高表達。見圖1。

圖1 鼻咽癌組織和癌旁組織中SIRT1蛋白表達量

2.2 鼻咽癌細胞中STRT1蛋白的表達量 鼻咽正常上皮細胞 NP69和鼻咽癌細胞 CNE-1、CNE-2、HNE-1和HNE-2中SIRT1蛋白表達如圖2所示。與鼻咽正常上皮細胞NP69比較，鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2、HNE-1中SIRT1蛋白表達水平增加，差異有統計學意義（F＝27.180，P＜0.05或 P＜0.01），提示SIRT1在鼻咽癌細胞中高表達。而鼻咽癌細胞CNE-1中SIRT1蛋白表達最高，故選擇CNE-1細胞進行STRT1作用效果及機制的后續研究。

圖2 人鼻咽正常上皮細胞NP69和鼻咽癌細胞HNE-2、HNE-1、CNE-1和CNE-2中SIRT1蛋白表達水平

2.3 SIRT1基因沉默效果檢測結果 用SIRT1 siRNA轉染CNE-1細胞6 h后，換液繼續培養24 h，提取細胞總RNA和總蛋白分別進行qRT-PCR和Western blot實驗，結果見圖3。與NC-siRNA組和Control組比較，SIRT1-siRNA組的SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白相對表達量均降低，差異有統計學意義（F＝5.648，F＝70.193，P＜0.01），表明轉染 SIRT1 siRNA能抑制CNE-1細胞中SIRT1的表達。

圖3 SIRT1基因沉默效果

2.4 X射線對SIRT1基因沉默細胞增殖的影響CCK-8結果顯示，與未接受X射線放射處理的Control組比較，放射劑量為4、6、8 Gy時，Control組細胞的增殖能力降低，差異有統計學意義（F＝37.372，P＜0.01），表明放療能抑制細胞的增殖；與Control組比較，不同放射劑量的SIRT1-siRNA組細胞增殖能力均被抑制，差異有統計學意義（X射線放射劑量為 0、2、4、6、8 Gy時對應 F值分別為 66.513、127.544、60.581、107.137和 64.029，P＜0.01），表明SIRT1沉默能抑制CNE-1細胞的增殖；與未接受X射線放射處理的SIRT1-siRNA組比較，放射劑量為4、6、8 Gy時，SIRT1-siRNA組細胞的增殖能力被抑制，差異有統計學意義（F＝15.592，P＜0.01），具體見圖4。結果提示放療能有效抑制鼻咽癌CNE-1細胞的增殖活性，且呈劑量依賴性，放療劑量越高，抑制效果越高，而沉默SIRT1可有效增加CNE-1細胞的放療敏感性。

圖4 SIRT1基因沉默對X射線抑制細胞增殖的影響

2.5 X射線對SIRT1基因沉默細胞凋亡的影響 流式細胞術結果見圖5，與未接受X射線放射處理的 Control組比較［（凋亡率為（4.38±0.50）%］，當X射線放射劑量為4、6、8 Gy時，Control組細胞凋亡率升高，差異有統計學意義［凋亡率分別為（11.30±0.74）%、（14.69±1.31）%、（23.77±2.32）%，F＝98.549，P＜0.01］，提示放療能誘導鼻咽癌CNE-1細胞發生凋亡。與Control組比較，不同劑量X射線放射下，SIRT1-siRNA組細胞凋亡率均升高，差異有統計學意義（X射線放射劑量為 0、2、4、6、8 Gy時對應 F值分別為 512.163、115.340、341.758、225.237和90.523，P＜0.01），表明SIRT1基因沉默能誘導CNE-1細胞發生凋亡。

圖5 SIRT1基因沉默對X射線促進細胞凋亡的影響

此外，SIRT1-siRNA組細胞隨著放射劑量的增加，其細胞凋亡率也逐漸升高，與未接受X射線放射處理的SIRT1-siRNA組細胞比較，SIRT1-siRNA組細胞在放射劑量為4、6、8 Gy時，凋亡率明顯增加，差異有統計學意義［凋亡率分別為（26.66±2.46）%、（32.79±1.63）%、（35.00±1.50）%，F＝50.476，P＜0.01］，提示放療能誘導 CNE-1細胞發生凋亡，且放療劑量越高，細胞凋亡率越高，而SIRT1基因沉默能有效增加放療對CNE-1細胞凋亡的誘導作用。

2.6 SIRT1基因沉默聯合放療對細胞凋亡相關蛋白的影響 各組細胞中凋亡相關蛋白表達情況見圖6，與未接受X射線放射處理的細胞比較，經8 Gy放射處理后，Control組、NC-siRNA組、SIRT1-siRNA組細胞中Bcl-2蛋白表達均降低，差異有統計學意義（F分別為 7.727、6.943、2.833，P＜0.05），而 Bax和Cleaved-Caspase3蛋白相對表達量增加，差異均有統計學意義（Bax：F分別為 1.873、0.502、0.848，P＜0.05；Cleaved-Caspase3：F分別為 1.469、0.259、0.591，P＜0.05）。與未接受 X射線放射處理的Control組細胞比較，經放射處理后SIRT1-siRNA組細胞Bcl-2蛋白表達降低，差異有統計學意義（F＝51.93，t＝8.467，P＜0.05），而 Bax和 Cleaved-Caspase3蛋白表達量升高，差異有統計學意義（F＝2.794，t＝-2.321；F＝1.469，t＝-4.772，P＜0.05）。與放療的Control組細胞比較，SIRT1-siRNA組細胞放療后 Bcl-2蛋白降低（F＝5.050，P＜0.05），而 Bax和 Cleaved-Caspase3蛋白表達升高（F＝7.436，P＜0.05；F＝29.387，P＜0.01）。研究結果提示，SIRT1基因沉默能增加放療對Bcl-2蛋白表達的抑制作用和對Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表達的促進作用。

圖6 SIRT1基因沉默聯合放療對細胞凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

SIRT1基因是一種酵母沉默信息調控因子SIRT2的同源基因，共33 kb個堿基，是重要的腫瘤調控基因。已有研究發現，SIRT1基因在前列腺癌、乳腺癌、皮膚癌等多種腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用。如 Lian et al報道，miR-128可通過抑制SIRT1促進結直腸癌細胞增殖。在乳腺癌中沉默SIRT1基因可抑制p53和激活POLD1蛋白，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移。Yeung et al研究發現上調SIRT1能抑制NF-κB的功能，從而促進肺癌細胞發生凋亡。由此可見，SIRT1在不同腫瘤中發揮著不同的生物學功能。然而，SIRT1在鼻咽癌組織中的表達和潛在作用鮮有報道。為了探究SIRT1在鼻咽癌組織中的表達，我們用Western blot技術分別在鼻咽癌組織及癌旁組織，以及人鼻咽上皮細胞和鼻咽癌細胞中檢測了SIRT1蛋白的表達情況，實驗結果發現，SIRT1蛋白在鼻咽癌組織中表達量高于對應癌旁組織。SIRT1蛋白在鼻咽癌細胞中的表達量也高于人鼻咽上皮細胞中的表達量。由此推測，SIRT1基因在鼻咽癌中高表達，其可能在鼻咽癌的發生發展中扮演著促癌基因的作用。王芳等報道，SIRT1基因表達水平與胃癌惡性表型呈負相關，可以作為預后良好的一個重要指標。因此，SIRT1基因也可能是鼻咽癌預后的生物標志物和治療靶點，沉默或敲低SIRT1基因可能是一種有效的控制鼻咽癌發生發展的治療手段。

為了進一步探究SIRT1基因在鼻咽癌發生發展中的作用，我們通過RNA干擾技術建立SIRT1基因沉默細胞株。首先，合成SIRT1基因的特異性siRNA片段，通過Lip 2000作為轉染媒介將siRNA片段轉染到CNE-1細胞，最后通過RT-qPCR和Western blot法驗證轉染效率，結果顯示本次實驗設計的siRNA片段能有效抑制CNE-1細胞中SIRT1 mRNA和蛋白的表達，說明我們成功構建了SIRT1基因沉默的鼻咽癌細胞。

放射治療是鼻咽癌最重要的治療方式之一，其能有效延長患者的生存時間。但是，鼻咽癌對放射敏感性存在很大的個體差異，部分患者的放療效果并不理想，影響了治療效果。因此，提高鼻咽癌的放療敏感性是目前需要攻克的主要難題。Zhu et al報道，沉默RelB基因的表達可以增加前列腺癌患者的放療敏感性。Zhou et al報道，用 RNAi技術沉默RNF8基因可以增強非小細胞肺癌A549的輻射敏感性。此外，抑制蛋白質激酶CK2也可增強非小細胞肺癌的放射敏感性。以上研究表明，部分癌基因沉默能提高腫瘤細胞對放療的敏感性，這為腫瘤的放射治療提供了新思路。但在鼻咽癌中，SIRT1基因對放療敏感性的影響還未被報道。為了探究SIRT1基因沉默對放療的增敏效果，我們首先通過CCK-8法檢測了SIRT1基因沉默及放療對鼻咽癌細胞CNE-1增殖活性的影響，實驗結果發現，SIRT1基因沉默和放射治療均能有效抑制CNE-1細胞的增殖能力，且SIRT1基因沉默能增加X射線照射對細胞增殖的抑制作用，提示SIRT1基因沉默能增加鼻咽癌細胞的放射敏感性。然而，最新研究證實，SIRT1激活劑能增加乳腺癌細胞對化療藥物和放射的敏感度。這也正如前文所述，SIRT1在不同的腫瘤中作用效果不同，進一步表明其在腫瘤發生發展中的復雜作用。

細胞凋亡是腫瘤放射治療的主要機制。放射敏感性的增加往往伴隨著細胞凋亡的發生。為了進一步探究SIRT1基因沉默對放療誘導鼻咽癌細胞發生凋亡的影響，通過流式細胞術檢測各組細胞的凋亡情況。研究結果發現，SIRT1基因沉默和X線放射均能誘導CNE-1細胞的凋亡，且當SIRT1基因沉默的鼻咽癌細胞被劑量為4、6、8 Gy的X射線放射處理后，細胞凋亡率增加。本研究中CNE-1細胞的存活率在SIRT1基因沉默后降低，其趨勢符合細胞凋亡的改變。以上結果表明，SIRT1基因沉默能增加X射線放射對鼻咽癌細胞凋亡的誘導作用，是促進鼻咽癌細胞死亡的有效方式。

細胞凋亡的發生受多個基因調控。Feng et al發現當轉移性頸淋巴源性頭頸鱗狀細胞癌HSC-4細胞的FANCD2基因沉默后，放射治療明顯增加了HSC-4細胞凋亡率，其機制涉及抑凋亡基因Bcl-2的下調及促凋亡基因Bax、Caspase3的上調。Bcl-2家族是已知細胞凋亡中最重要的調控因子，其成員之間特殊的比值在細胞凋亡過程中起關鍵性作用。Bax具有促細胞凋亡作用，而Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用。Bcl-2／Bax的比值降低導致線粒體膜電位下降，線粒體膜完整性和功能被破壞，從而導致細胞色素C等凋亡因子釋放，激活下游Caspase3。Caspase3作為關鍵的凋亡執行蛋白，其活性形式Cleaved-Caspase3表達量能反映細胞的凋亡水平。為了進一步驗證SIRT1基因沉默對X射線放射誘導鼻咽癌細胞凋亡的促進作用和可能機制，我們用Western blot檢測了各組細胞中Bcl-2、Bax和Cleaved-Caspase3蛋白的表達，發現用8 Gy的X射線放射處理SIRT1基因沉默的CNE-1細胞，促凋亡基因 Bax和Cleaved-Caspase3增加，抑凋亡基因Bcl-2表達降低，說明Caspases級聯反應被激活。以上結果表明SIRT1沉默可能通過活化Caspase級聯反應來促進CNE-1細胞的凋亡。但SIRT1沉默對凋亡的調控具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，SIRT1基因沉默后，鼻咽癌CNE-1細胞對放射的敏感性得到顯著提高，說明SIRT1基因與鼻咽癌CNE-1細胞對放射的敏感性有密切的關系，這為鼻咽癌治療靶點開發提供了新思路。