輪狀病毒通過STAT3磷酸化對腸道炎癥的影響及機制研究

張曉燕，章孝成，丁 銳，何茂章，黃升海，

輪狀病毒（rotavirus，RV）是呼腸孤病毒科的一組分節(jié)段的雙鏈RNA病毒，也是引起全球范圍內(nèi)嬰幼兒腹瀉的最常見病原體之一。RV通過糞口途徑傳播，主要感染的部位是小腸上部或小腸上皮細胞，嚴重者會累及整個小腸，其主要在絨毛頂端柱狀上皮細胞內(nèi)復(fù)制。腸道炎癥近年來備受關(guān)注，白細胞介素-22（interleukin-22，IL-22）在腸道炎癥的發(fā)生和發(fā)展中表現(xiàn)出雙面性。研究表明，在小腸的十二指腸段和回腸的隱窩處有一類特化的腸道上皮細胞為潘氏細胞（Paneth），一方面它為腸道上皮干細胞提供干細胞壁龕，另一方面它會分泌抗菌肽RegⅢ-γ進入腸道黏液屏障，調(diào)節(jié)腸道炎癥，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的磷酸化是RegⅢ-γ發(fā)揮作用的重要因素。研究還發(fā)現(xiàn)，腸道上皮細胞表面存在IL-22受體，IL-22與其結(jié)合后可以激活STAT3。因此該研究采用 RV灌胃感染7日齡BALB／c乳鼠，運用Western blot、ELISA檢測相關(guān)蛋白 STAT3、pSTAT3、RegⅢ-γ和IL-22的表達情況，探討RV通過STAT3磷酸化對腸道炎癥的影響及其具體機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與病毒株 恒河猴胚胎腎細胞MA104細胞株，輪狀病毒RV VR2018病毒株均購自中科院武漢病毒研究所，本課題組自行增殖、保存。病毒復(fù)蘇后在MA104細胞上進行增殖，經(jīng)測定RV病毒的TCID為 10／0.1 ml。

1.2 實驗動物 SPF級BALB／c小鼠36只，7～8周齡，其中24只雄鼠、12只雌鼠，由安徽省實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于獨立送風隔離籠具系統(tǒng)內(nèi)，該系統(tǒng)由安徽醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院動物房提供，等級為P2級。待雌雄鼠自行配種生產(chǎn)乳鼠，隨機選取250只7日齡BALB／c乳鼠，體質(zhì)量3.5～4.0 g，用于實驗。

1.3 動物模型建立與實驗分組 將自行配種生產(chǎn)的SPF級7日齡BALB／c乳鼠隨機分成5組，每組50只，分別為：（1）正常對照組：不經(jīng)任何處理；（2）PBS對照組：無菌200μl磷酸鹽緩沖液（PBS）乳鼠灌胃；（3）RV感染組：RV（TCID為 10／0.1 m l）100μl灌胃感染乳鼠；（4）RV+STAT3抑制劑組：STAT3濃度為1.5×10mg／ml，在RV感染18 h后100μl灌胃感染乳鼠且每間隔18 h灌胃一次，直至感染的第10天結(jié)束；（5）STAT3抑制劑組：每間隔18 h用100μl STAT3抑制劑對乳鼠進行灌胃，濃度同上，連續(xù)灌胃10 d。5組分別在感染后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天各處死 5只小鼠并收集腸組織標本。預(yù)實驗分別選用0.75×10、1.5×10、3×10mg／ml三種不同濃度STAT3抑制劑灌胃感染乳鼠，通過Western blot方法檢測乳鼠腸組織中pSTAT3與STAT3蛋白的表達情況，結(jié)果表明，后兩種濃度均能顯著抑制STAT3的磷酸化即pSTAT3蛋白表達的下降。

1.4 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；小牛血清購自蕪湖天明生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜購自美國biosharp公司；蛋白印跡用ployvinylidene fluoride膜購自美國biosharp公司；蛋白凝膠用標記 Marker購自上海Sangon生物工程技術(shù)和服務(wù)公司；內(nèi)參鼠抗 β-actin蛋白抗體購自武漢Elabscience生物科技有限公司；兔抗Anti-REG3G蛋白抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗STAT3蛋白抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗pSTAT3蛋白抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；鼠IL-22高靈敏聯(lián)檢測定量試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.5 樣本的收集與檢測 病毒灌胃后每日處死乳鼠，在生物安全柜中無菌取乳鼠小腸組織，通過HE染色觀察乳鼠小腸組織病理變化；ELISA檢測腸黏膜勻漿液IL-22含量的變化情況；Western blot檢測各組不同時間點STAT3、pSTAT3和RegⅢ-γ蛋白水平的表達變化。

2 結(jié)果

2.1 乳鼠小腸組織病理學結(jié)果

2.1.1 各組乳鼠小腸組織病理學結(jié)果 取乳鼠小腸組織做病理切片，經(jīng)HE染色觀察結(jié)果顯示：正常對照組（圖1A）和PBS組結(jié)果基本沒有差別，都可見清晰的小腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層4層結(jié)構(gòu)，細胞胞質(zhì)致密，小腸絨毛排列整齊，絨毛外單層柱狀細胞排列整齊。實驗組即RV感染組（圖1B）、RV+STAT3抑制劑組（圖 1C）、STAT3抑制劑組（圖1D）出現(xiàn)明顯的病變。RV感染組：黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層4層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂，組織細胞出現(xiàn)空泡，為細胞水腫；細胞雜亂伴有空隙，提示有炎癥細胞浸潤；小腸絨毛斷裂，絨毛長度變短，絨毛上皮細胞疏松，與黏膜層分離，再次提示水腫；小腸上皮細胞刷狀緣疏松，紫色深染的細胞核團聚的現(xiàn)象；小腸絨毛內(nèi)有深染的紅色，提示血管充血擴張，有出血的可能。RV+STAT3抑制劑組和STAT3抑制劑組也出現(xiàn)炎癥細胞浸潤、水腫，小腸絨毛部分斷裂的現(xiàn)象，與RV感染組小腸絨毛相比受損程度均較低，未出現(xiàn)小腸絨毛與黏膜層分離的現(xiàn)象，但其水腫情況更為突出，小腸絨毛上皮細胞刷狀緣排列與RV感染組相比較為規(guī)整。感染組雖然都能出現(xiàn)病變，但RV感染組與RV+STAT3抑制劑組、STAT3抑制劑組比較，主要小腸組織病變部位有稍許差別，提示損傷機制不一樣，結(jié)果見圖1。

圖1 BALB／c乳鼠各組病理學變化 HE×100

2.1.2 RV感染不同時間點病理學結(jié)果 取RV感染不同時間點乳鼠小腸組織做病理切片，經(jīng)HE染色結(jié)果顯示：感染第1天（圖2A）就出現(xiàn)水腫、絨毛破裂等炎癥表現(xiàn)，但絨毛刷狀緣細胞排列較規(guī)整；感染第2～4天（圖2B～D）出現(xiàn)炎癥加重的現(xiàn)象，水腫加重，絨毛脫落，絨毛刷狀緣細胞不規(guī)整；感染第5～8天（圖2E～H）可以看見小腸組織在逐步恢復(fù)，絨毛開始逐漸恢復(fù)并排列整齊；感染第9～10天（圖2I～J）小腸組織均出現(xiàn)不同程度的炎癥，但沒有RV感染組的第2～4天的程度嚴重。

圖2 BALB／c乳鼠RV感染不同時間點的病理學變化 HE×100

2.2 BALB／c乳鼠小腸組織各組不同時間點IL-22表達水平檢測 正常對照組與PBS組沒有明顯的差別，RV感染第1～6天IL-22表達水平有所升高，其中在感染后第4天的水平最高，在感染后第7～10天與正常對照組IL-22表達水平相當，其中從第1天開始差異有統(tǒng)計學意義（F＝139.0，P＝0.014 3）。與正常對照組比較，RV+STAT3抑制劑組和STAT3抑制劑組乳鼠腸組織IL-22水平逐漸升高，在感染后的第1～6天，RV+STAT3抑制劑組IL-22表達水平升高較STAT3抑制劑組更明顯，在感染的第7天后兩組差異無統(tǒng)計學意義。與RV感染組比較，RV+STAT3抑制劑組IL-22表達水平逐漸升高，在第4天達到最高（F＝23.5，P＜0.001），結(jié)果見圖3。

圖3 各組感染BALB／c乳鼠小腸組織各時間點IL-22表達水平

2.3 各組BALB／c乳鼠小腸組織不同感染時間點STAT3、pSTAT3和RegⅢ-γ蛋白的表達情況

2.3.1 各組BALB／c乳鼠小腸組織不同感染時間點STAT3的表達情況 采用Western blot檢測各組蛋白的表達情況。結(jié)果顯示：正常對照組和PBS組STAT3表達水平在不同時間點變化不大；RV感染組第1～4天表達水平逐漸降低且在第4天最低，第5～7天表達水平逐漸升高，第8～10天與正常對照組相當；RV+STAT3抑制劑組在第1～2天表達水平較低，第3～4天表達水平有所升高，第5～10天表達水平較高，但不同時間點變化不大；STAT3抑制劑組在每天都維持在高表達水平，但不同時間點變化不大，結(jié)果見圖4。

圖4 各組感染BALB／c乳鼠小腸組織各時間點STAT3表達水平

2.3.2 各組BALB／c乳鼠小腸組織不同感染時間點pSTAT3的表達情況 采用Western blot檢測各組pSTAT3蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，其與STAT3表達的趨勢相反。正常對照組和PBS組的pSTAT3表達水平在不同時間點變化不大；RV感染組第1～4天表達水平逐漸升高且第4天最高，第5～7天表達水平逐漸降低，第8～10天與正常對照組相當；RV+STAT3抑制劑組在第1～2天表達水平較高，低于RV感染組但略高于正常對照組，第3～10天表達水平逐漸降低，低于RV感染組；STAT3抑制劑組表達水平逐漸降低，低于RV感染組，結(jié)果見圖5。

圖5 各組感染BALB／c乳鼠小腸組織各時間點pSTAT3表達水平

2.3.3 各組感染BALB／c乳鼠小腸組織不同時間點RegⅢ-γ蛋白的表達情況 采用Western blot檢測各組RegⅢ-γ蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，RegⅢ-γ表達趨勢與pSTAT3一致，正常對照組和PBS組RegⅢ-γ表達水平在不同時間點變化不大；RV感染組第1～4天表達水平逐漸升高且第4天最高，第5～7天表達水平逐漸降低，第8～10天與正常對照組相當；RV+STAT3抑制劑組在第1～2天表達水平較高，低于RV感染組，略高于正常對照組，第3～10天表達水平逐漸降低，低于RV感染組；STAT3抑制劑組表達水平逐漸降低，低于RV感染組，結(jié)果見圖6。

圖6 各組感染BALB／c乳鼠小腸組織各時間點RegⅢ-γ表達水平

3 討論

RV是引起腸道腹瀉的重要病毒，主要在全球范圍內(nèi)引起5歲以下兒童的嚴重腹瀉。相關(guān)文獻報道，RV感染后通過病理學觀察，可見腸道上皮細胞的持續(xù)空泡化、水腫以及小腸絨毛長度變短等炎癥變化。本實驗病理結(jié)果也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：RV感染的第1天就出現(xiàn)水腫、絨毛破裂等炎癥表現(xiàn)，但絨毛刷狀緣細胞排列較規(guī)整；感染第2～4天出現(xiàn)炎癥加重的現(xiàn)象，水腫加重，絨毛脫落，絨毛刷狀緣細胞不規(guī)整；感染第5～8天可見小腸組織在恢復(fù)，絨毛開始逐漸恢復(fù)并排列整齊；絨毛長度前3 d變短，第4～8天逐漸變長，表明雖然第4天絨毛有恢復(fù)的趨勢，但由于小腸基層的破環(huán)加重，整體炎癥水平也加重。通過病理切片結(jié)果說明RV感染小腸組織后存在損傷到修復(fù)的過程，然而在感染的第9～10天和正常對照組的第10天小腸組織均出現(xiàn)程度較小的炎癥表現(xiàn)，分析可能的原因有兩點：① HE的結(jié)果是對病變的主觀判斷，很難用數(shù)據(jù)量化；② 實驗選取的是7日齡的乳鼠，在病毒感染的第10天后乳鼠的日齡達到三周齡，乳鼠進食材料開始由母乳轉(zhuǎn)為飼料，可能飲食結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致了輕微的炎癥反應(yīng)。另外，RV感染和STAT3抑制劑都會對腸道組織產(chǎn)生一定破壞，但通過HE結(jié)果來看，RV更傾向于對小腸絨毛的損傷，這可為后續(xù)的研究提供參考。

另外，RV感染可致細胞因子 IL-6、IL-10、IFN-γ有明顯的升高。相關(guān)報道IL-6可與腸道中Th17細胞上的IL-6受體結(jié)合，通過STAT3信號通路誘導(dǎo)IL-22表達。IL-22作為腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IEC）中重要的免疫細胞因子，通過STAT3通路活化BIRC5、pla2g5、SMO、MYC和 MCL1等基因促進 IEC細胞增殖，但 IL-22對 STAT3的過度磷酸化又會促使細胞凋亡。本實驗中RV感染和RV+STAT3抑制劑會誘導(dǎo)IL-22的升高，通過STAT3、pSTAT3、RegⅢ-γ蛋白 Western blot結(jié)果顯示，IL-22的升高會激活STAT3的磷酸化，從而磷酸化的STAT3能促進RegⅢ-γ的釋放。單純STAT3抑制劑雖然能誘導(dǎo) IL-22升高，但由于抑制了STAT3的磷酸化，沒有促進RegⅢ-γ釋放。表明RV可以通過誘導(dǎo)IL-22激活pSTAT3信號通路促進RegⅢ-γ釋放。

常見的腸道炎癥疾病包含克羅恩病與潰瘍性結(jié)腸炎等，IL-22在不同的腸道炎癥疾病中表達水平存在差異性，文獻報道克羅恩病患者與潰瘍性結(jié)腸炎患者的腸組織中IL-22表達水平相比較前者明顯高于后者。機體中，IL-22因不同炎癥調(diào)節(jié)因素之間的相互作用不同而發(fā)揮著保護或損傷的作用，在腸易激綜合征中，T-bet轉(zhuǎn)錄因子的缺乏可引起IL-23因子的高度表達，在此刺激下的IL-22發(fā)揮著致病作用，而在潰瘍性結(jié)腸炎中，有Th2細胞反應(yīng)介導(dǎo)的IL-22可增強腸道組織黏膜的保護作用。另外，腸道發(fā)生炎癥時，腸上皮的Paneth細胞分泌RegⅢ-γ發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道生物屏障的作用。相關(guān)研究表明IL-22可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生RegⅢ-γ，RegⅢ-β等抗菌肽，其可能機制與IL-22介導(dǎo)pSTAT3激活STAT3信號通路有關(guān)。本研究中，RV感染后，IL-22的表達升高，其中在感染的第4天達到最高峰，pSTAT3與RegⅢ-γ蛋白的表達均在RV感染的第4天達到高峰，結(jié)合 IL-22、pSTAT3、RegⅢ-γ的表達水平，說明RV感染后刺激IL-22的釋放，一方面誘導(dǎo)產(chǎn)生腸道炎癥，另一方面高表達的 IL-22通過STAT3磷酸化激活STAT3信號通路誘導(dǎo)產(chǎn)生RegⅢ-γ，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道炎癥的作用。