基于質譜測定小分子與Aβ親和力的受體結合分析方法的建立和驗證

彭麗朵，代雅倩，徐元宏，吳丹丹，江桃山，喬金平

阿爾茨海默病（alzheimer′s disease，AD）是一種神經退行性疾病，淀粉樣蛋白-β（Aβ）斑塊是AD病理學特征之一，主要有Aβ1-40和 Aβ1-42兩種形式，通過PET等檢測Aβ斑塊可用于AD的早期診斷。硫黃素 T（Thioflavin T，ThT）的類似物，包括11C-PIB、IMPY是常見的分子探針，其中IMPY與Aβ的親和力強、特異性好，所以常被用作放射性受體結合分析中的陽性參比配體。Aβ分子探針開發早期，常使用放射性受體結合實驗檢測其與Aβ的親和力。盡管該方法靈敏度高、重復性好，但放射性同位素（H、I）標記帶來了一系列成本及安全問題。隨著質譜技術的發展，結合液相色譜 -質譜（liquid chromatography-massspectrometry，LC-MS）的高靈敏度，有研究小組開發出基于質譜的受體結合分析方法（MS binding assays，MSBA），使用非放射性配體并經質譜進行定量檢測。該研究旨在建立基于LC-MS的受體結合分析方法，測定IMPY的親和力，并與文獻中放射性受體結合實驗數據相比較，驗證MSBA的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 IMPY（CHIN，363.20 g／mol）、IMPY-D（CHDIN，369.23 g／mol）由安徽農業大學生命科學學院合成，人Aβ1-40及Aβ1-42購自廣州市銳博生物科技有限公司，乙腈購自美國TEDIA公司，牛血清白蛋白（BSA）購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.2 主要儀器 API 3200DX質譜儀（美國AB Sciex公司），Shimadzu Nexera X2高效液相系統、Shim-pack GISSC液相色譜柱（日本島津公司，1.9 μm，2.1 mm×50 mm），ZT-Ⅱ型細胞收集器（紹興市衛星醫療設備制造有限公司），DSH-300A水浴恒溫振蕩儀（蘇州培英實驗設備有限公司），BE-9010微孔板恒溫振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），5810R臺式離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 合成 IMPY與 IMPY-D參照文獻合成IMPY，再按照圖1合成IMPY的氘代產物IMPY-D。

圖1 IMPY-D6的合成

1.2.2 建立IMPY及IMPY-D的LC-MS方法 按照IMPY及IMPY-D分子量，以二甲基亞砜為溶劑配制濃度為1×10mol／L溶液，再用80%乙腈（Milli-Q超純水∶乙腈＝1∶4）稀釋得到終濃度為1×10mol／L的工作液。按常規方法設置質譜參數，然后于MRM模式下，依次優化各離子對的質譜方法參數：去簇電壓（DP）、入口電壓（EP）、碰撞能量（CE）、碰撞池出口電壓（CXP）、溫度（TEM）、離子化電壓（IS）、氣簾氣（CUR）、噴霧氣（GS1）、輔助加熱氣（GS2）、噴撞氣（CAD）。連接好液相色譜（LC）系統部分，A泵流動相為Mini-Q超純水，B泵流動相為乙腈，選擇LC-MS模式，在質譜方法基礎上添加LC條件。LC總流速為0.4 ml／min，柱溫為40℃，進樣量20μl，時間為5 min，梯度洗脫模式，通過重復進樣，優化LC條件。保存IMPY及IMPY-D質譜參數及液相色譜條件，得到IMPY與IMPY-D的LC-MS方法。

1.2.3 建立基于LC-MS平臺的定量方法 取IMPY（1×10mol／L）溶液，使用 80%乙腈依次進行10倍稀釋，得到5個濃度的IMPY的標準溶液（1×10～1×10mol／L）。再以 80%乙腈為溶劑配制內標溶液 IMPY-D（5×10mol／L）。取 450μl IMPY標準溶液加入50μl內標溶液IMPY-D（5×10mol／L），渦旋混勻后得到5個濃度的標準品。使用已建立的LC-MS方法，自低濃度向高濃度檢測5個標準品，根據方法向導建立IMPY與IMPY-D的定量方法，指定IMPY-D為內標化合物，并選定IMPY的定量離子對，輸入理論濃度，手動或自動積分后，進行標準曲線的擬合并記錄相關系數（r值）。

1.2.4 MSBA-飽和結合實驗 實驗方法參照放射性受體結合實驗方法，但 MSBA無需使用放射性同位素標記。首先以0.02%氨水 ∶PBS（0.04 mol／L）為1∶9的比例配制 Aβ1-40與Aβ1-42，終濃度為5×10mol／L，渦旋混勻后，于37℃旋轉孵育聚集 96 h。再以 PBS（0.01 mol／L）稀釋 5倍得到Aβ（1×10mol／L）溶液。反應體系分為8管總結合管（TB）以及2管非特異性結合管（NSB），分別加樣至12 mm×75 mm玻璃管（美國Fisher公司）中。總結合管加樣順序如下：700μl0.1%PBS／BSA（使用0.01 mol／L PBS稀釋 BSA獲得）；100μl IMPY（1×10～7.813×10mol／L，依次 2倍稀釋），200μl Aβ（1×10mol／L）。非特異性結合管另外加入100μl競爭配基 ThT（1×10mol／L），保持總體積為1 ml。Parafilm封口，渦旋混勻30 s。所有試驗管放入水浴振蕩儀（37℃，200 r／min）中孵育2 h。使用加有 Whatman GF／B濾膜（提前于4℃，0.5%聚乙烯亞胺中浸泡2 h）的ZT-Ⅱ型細胞收集器抽濾分離得到與Aβ結合的IMPY，50℃20min烘干濾膜，將濾膜片置于0.5 ml離心管中，以360 μl乙腈溶解濾膜上截留的IMPY，置于微孔板恒溫振蕩器上（37℃，1 000 r／min）孵育30 min。再加入90μl Mini-Q水、50μl內標溶液 IMPY-D（5×10mol／L），渦旋混勻后，15 000 r／min離心 5 min，吸取200μl上清液及200μl標準品至96孔板中，使用“1.2.2”項下建立的IMPY與IMPY-D的LC-MS方法依次進樣，檢測結束后使用建立的定量方法進行積分定量，導出數據，經GraphPad Prism 7.0分析得出平衡結合常數（K值）。每次實驗每個濃度梯度的配體做兩復管，重復3次實驗，以3次實驗的K平均值±標準誤得到最終K值。

1.2.5 MSBA-競爭結合實驗 實驗步驟與飽和結合實驗類似，僅反應體系稍有不同，以不同濃度的IMPY-D溶液（1×10～3×10mol／L）與等量的IMPY溶液（1.25×10mol／L）競爭結合 Aβ（1×10mol／L），反應體系總體積為 1 ml，K＝IC／（1+LT／K）（LT為競爭配體的終濃度即1.25×10mol／L），經檢測分析得到抑制常數（K值），以三次實驗的K平均值±標準誤得到最終K值。

1.3 統計學處理 使用GraphPad Prism 7.0分析得到K及K值。然后使用Excel2016，計算3次實驗的平均值、標準差、標準誤以及CV值。

2 結果

2.1 IMPY-D的鑒定 成功合成了IMPY及IMPY-D，IMPY的核磁圖譜見圖2，IMPY-D的核磁圖譜見圖 3。IMPY：H NMR（600 MHz，CDCl）δ 8.30（s，1H），7.79（d，J＝8.4 Hz，2H），7.64（s，1H），7.37（d，J＝9.0 Hz，1H），7.27（d，J＝9.0 Hz，1H），6.76（d，J＝8.4 Hz，2H），3.00（s，6H）；C NMR（150 MHz，CDCl）δ150.5，147.0，144.1，131.9，130.1，127.0，121.2，118.0，112.4，106.2，74.4，40.4。IMPY-D：H NMR（600 MHz，CDCl）δ 8.31（s，1H），7.79（d，J＝8.4 Hz，2H），7.65（s，1H），7.38（d，J＝9.0 Hz，1H），7.27（d，J＝9.0 Hz，1H），6.75（d，J＝8.4 Hz，2H）；C NMR（150 MHz，CDCl）δ150.6，147.0，144.1，131.9，130.1，127.0，121.1，118.0，112.3，106.2，74.4，39.5（seq，J＝21.0 Hz）。

圖2 IMPY的核磁圖譜

圖3 IMPY-D6的核磁圖譜

2.2 IMPY與IMPY-D的LC-MS參數 正離子模式下成功建立了IMPY與IMPY-D的LC-MS方法（見表1），色譜圖見圖4，IMPY有一個定量離子對（364.100／236.300），兩個定性離子對（364.100／348.200，364.100／193.300）。IMPY-D有一個定量離子對 （370.200／243.200），兩個定性離子對（370.200／350.000，370.200／193.200）。液相色譜條件為梯度洗脫模式，總洗脫時間為5 min。0.01～0.50 min，乙腈比例 20%；0.50～1.00 min，乙腈比例20% ～80%；1.00～3.00 min，乙腈比例80%；3.00～3.50 min，乙腈比例80% ～100%；3.50～4.00 min，乙腈比例 100%；4.00～4.50 min，乙腈比例100%～20%；4.50～5.00 min，乙腈比例20%至檢測結束。IMPY的保留時間為2.54 min，IMPY-D保留時間為2.52 min。使用建立的定量方法對標準品進行積分，得到標準曲線為Y＝（5.57×10）X+0.118，r＝0.999 9。

圖4 IMPY與IMPY-D6的LC-MS色譜圖

表1 IMPY與IMPY-D6的LC-MS方法質譜參數

2.3 飽和結合實驗（K值） 如表2及圖5所示，IMPY與Aβ1-40及 Aβ1-42的 K值分別為（3.80±0.39）和（18.38±1.11）nmol／L。3次實驗的CV值均在15%以內。三組飽和結合曲線與表2中的K值一一對應。文獻中放射性受體結合實驗測得的IMPY與AD人腦勻漿結合的K值為（5.3±1.0）nmol／L。

表2 IMPY與Aβ的平衡結合常數（nmol／L）（NSB競爭配體為ThT）

圖5 IMPY與Aβ1-40及Aβ1-42的飽和結合曲線

2.4 競爭結合實驗（K值） 競爭結合實驗以相同濃度的IMPY與不同濃度的IMPY-D競爭結合Aβ 1-40及Aβ1-42，實驗結果見表3及圖6。IMPY與IMPY-D競爭結合Aβ1-40及Aβ1-42的K值分別（18.64±0.76）和（25.44±2.38）nmol／L，三次實驗CV值均在10%以內。三組競爭結合曲線與表3中的K值一一對應。文獻中放射性受體結合實驗測得的IMPY和I-TZDM競爭結合Aβ1-40的 K值為（15±5）nmol／L，IMPY和I-IMPY競爭結合AD人腦勻漿競爭K值為（5.0±0.4）nmol／L。

表3 IMPY與IMPY-D6競爭結合Aβ的抑制常數（nmol／L）

圖6 IMPY與IMPY-D6的競爭結合曲線

3 討論

本研究中飽和結合實驗的結果顯示，使用MSBA測得的IMPY與Aβ1-40及Aβ1-42的K分別為（3.80±0.39）和（18.38±1.11）nmol／L，與使用放射性受體結合實驗測定的IMPY與AD人腦勻漿中的Aβ纖維（無法區分Aβ1-40和Aβ1-42）結合的K結果（5.3±1.0）nmol／L基本一致。在競爭結合實驗中，使用MSBA測得的IMPY與IMPY-D競爭結合 Aβ1-40的 K值為（18.64±0.76）nmol／L，IMPY與 IMPY-D競爭結合 Aβ1-42的K值為（25.44±2.38）nmol／L，也與放射性受體結合實驗測定的結果接近，其中放射性受體結合實驗測得的IMPY和I-TZDM競爭結合Aβ1-40纖維的K值為（15±5）nmol／L，測得的 IMPY和I-IMPY競爭結合AD人腦勻漿（無法區分Aβ1-40和 Aβ1-42）的 K值為（5.0±0.4）nmol／L。有研究表明，體外合成的Aβ及APP／PS1轉基因小鼠腦勻漿中的PIB高親和力位點顯著少于AD人腦勻漿中的PIB高親和力位點，IMPY和PIB都是硫黃素的類似物，與Aβ的親和力位點相似，這也就解釋了本實驗中IMPY的親和力數據在合成的Aβ（MSBA）與AD人腦勻漿（放射性受體結合分析）中存在一定的差距。

LC-MS平臺檢測限可達 ng／mL甚至 pg／mL，可用于檢測濃度為1×10～1×10mol／L的小分子化合物，本實驗中IMPY的K平均值為3.80×10mol／L，在此檢測限范圍內，因此MSBA可直接用于檢測與Aβ結合的IMPY的量。

MSBA是在放射性受體結合實驗的條件基礎上，使用質譜儀代替伽馬計數器或液體閃爍計數器，無需使用放射性同位素標記，直接測定配體與其靶標的親和力。將MSBA應用于親和力測定可大大降低結合實驗的風險和難度、減輕實驗人員的工作強度，并且該實驗在普通實驗室即可完成，該方法通用性強，可大大提高受體拮抗劑或激動劑類藥物的研究。本實驗測定的IMPY與Aβ的K及K值經過多次重復實驗得到，CV值均低于15%，測定結果穩定，提示MSBA的飽和結合實驗及競爭結合實驗可在LC-MS平臺上穩定進行。

本研究使用3200MD質譜儀進行實驗，同時我們也使用安徽醫科大學科研實驗中心AB 5500質譜儀（AB SCIEX Triple Quad5500，美國）進行對比，測得的K和K值基本一致。由于后者檢測限更低，實驗過程可相對簡化。實驗選用IMPY的氘代內標，準確性更高，但氘代內標價格相對昂貴，實際研究中可使用外標法進行質譜的定量，通用性和難度會更低。待測化合物與Aβ的親和力測定是Aβ分子探針的篩選的關鍵環節，MSBA將大大降低篩選難度。目前，尚無文獻報道MSBA用于Aβ分子探針親和力的檢測。

綜上所述，本研究將MSBA成功應用于Aβ分子探針的親和力測定實驗中，該方法必將推動Aβ分子影像探針特別是基于MRI等非放射性Aβ分子影像探針的發展。文獻報道有多項研究基于LC-MS平臺成功建立了小分子化合物或多肽與其相應受體的親和力測定方法，表明 MSBA在非放射性結合實驗中具有廣闊的應用前景。