TM 6SF2在肝癌中的差異表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

汪一村，徐 東，陸歡華，沈衛(wèi)星，王曉亮，吳偉新

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種臨床上高病死率的原發(fā)性肝癌，是全球排名第3位癌癥相關(guān)死亡原因。中國(guó)腫瘤登記中心最新公布的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：2015年新發(fā)惡性腫瘤約429萬(wàn)例，死亡人數(shù)約281萬(wàn)；其中肝癌新發(fā)病例約46.61萬(wàn)，死亡人數(shù)約42.21萬(wàn)例，嚴(yán)重威脅人類的生命與健康。近期諸多外顯子組和全基因組測(cè)序?qū)Ω伟┑倪z傳機(jī)制研究提供了廣泛的數(shù)據(jù)，然而，目前已鑒定出的候選基因的生物學(xué)功能在很大程度上仍是未知的?？缒さ鞍?超家族成員2（transmembrane 6 superfamily member2，TM6SF2）位于19號(hào)染色體上，為7～10次跨膜蛋白，表達(dá)具有一定的組織特異性，主要分布于肝臟、小腸、腦組織和腎臟中。已有高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析表明TM6SF2在肝癌中低表達(dá)，但對(duì)其發(fā)揮作用的具體機(jī)制缺乏深入報(bào)道。該研究基于TM6SF2在肝癌中的表達(dá)特點(diǎn)并分析與預(yù)后關(guān)系的基礎(chǔ)上，旨在研究其在肝癌細(xì)胞發(fā)揮功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本與主要試劑

1.1.1 病例資料與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 選取2016年10月—2018年12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院HCC手術(shù)患者，共計(jì)15例，取肝癌組織（非壞死區(qū)腫瘤組織，大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）及癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm的肝硬化組織，大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）。所有新鮮組織獲取后立即轉(zhuǎn)入液氮固定。肝癌細(xì)胞系Hep G2及正常肝細(xì)胞L-02購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑 TM6SF2（ab169629）、內(nèi)參 GAPDH（ab181602）一抗抗體購(gòu)自英國(guó) Abcam公司；高效RIPA裂解液（組織／細(xì)胞）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Transwell小室購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC／PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 Transfection Reagent購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)肝癌組織TM6SF2表達(dá)量 組織切片經(jīng)過烤片、水化、抗原修復(fù)，分別滴加一抗和二抗，DAB顯色，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡拍照，采用IPP軟件對(duì)圖片進(jìn)行積分光密度（integrated option density，IOD）測(cè)量。

1.2.2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞TM6SF2表達(dá) 收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉1 h。PVDF膜分別加入稀釋的TM6SF2和GADPH一抗，4℃輕搖過夜；隨后加入相應(yīng)的二抗（1∶1 000稀釋），37℃恒溫?fù)u床孵育1 h，顯影。

1.2.3 過表達(dá)TM6SF2穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建與效率鑒定 慢病毒包裝TM6SF2過表達(dá)質(zhì)粒載體（PCDNA 3.1-TM6SF2）及對(duì)照質(zhì)粒載體（PCDNA 3.1-NC）。培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%消化接種到6孔板中，感染病毒。其中感染PCDNA 3.1-TM6SF2病毒的記為過表達(dá)組、感染PCDNA 3.1-NC病毒的記為對(duì)照組、未進(jìn)行任何處理細(xì)胞記為空白組。48 h后換帶有濃度400μg／ml的G418完全培養(yǎng)基加入篩選細(xì)胞，每2 d換液，培養(yǎng)2周，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集樣品，Western blot檢測(cè)TM6SF2蛋白表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：每組細(xì)胞以每孔加入100μl 2 000個(gè)細(xì)胞鋪于96孔板，培養(yǎng)至48 h，每孔加入10μl CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，450 nm測(cè)定吸光度?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)：取各組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。取1 000個(gè)細(xì)胞懸液接種含培養(yǎng)液的6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色10～30 min，拍照統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 三組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1 000 r／min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取5～10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1 000 r／min離心 5 min，棄上清液，加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，立即上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 將凍存于-80℃冰箱的BD matrigel 4℃過夜（24 h），變成液態(tài)，稀釋5倍后置于Transwell小室上室中，37℃培養(yǎng)箱孵育4～5 h，出現(xiàn)“白色層”時(shí)，說(shuō)明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。制備兩組細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度均為1×10個(gè)／ml，每孔小室加入150μl細(xì)胞懸液，下室中加入750μl含有10%FBS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中，孵育24 h。取出Transwell小室用PBS洗2遍，細(xì)胞固定液固定20 min，加入結(jié)晶紫（0.1%）染色10 min，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察。以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.2.7 q-PCR檢測(cè)TM6SF2和SLC27A5基因表達(dá) TRIzol法提取組織總RNA，取10μl RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量分析，定量反應(yīng)體系按照12.5μl SYBR Premix Ex Taq、1μl PCR Forward Primer、1μl PCR Reverse Primer、2μl cDNA模板、8.5μl ddHO，總體積為25μl，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行孔。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、20 s，40個(gè)循環(huán)；采用 2法計(jì)算TM6SF2和SLC27A5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。各基因特異性引物如下：TM6SF2（F：5′-CCCTAAGGTGCAGATGCTGA-3′；R：5′-CACGGTAGGTGAAGGGTGTG-3′），SLC27A5（F：5′-CTTCCTCTACTTCCGCGACC-3′；R：5′-TTACCCTCACAACCTGGCAC-3′）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行比較，如方差分析結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的兩兩比較。應(yīng)用χ檢驗(yàn)配對(duì)分析TM6SF2和SLC27A5表達(dá)的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并進(jìn)行Log-Rank分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TM 6SF2在肝癌中差異表達(dá) 免疫組化IOD值量化結(jié)果表明，TM6SF2在肝癌組織中相對(duì)表達(dá)值為（249.3±31.60），在癌旁組織中相對(duì)表達(dá)值為（522.3±46.61），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.847，P＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示，相對(duì)于人正常肝細(xì)胞系L-02，TM6SF2在肝癌細(xì)胞Hep G2中表達(dá)降低。同時(shí)，基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)可視化軟件UALCAN分析TM6SF2在肝癌中表達(dá)，結(jié)果表明TM6SF2在肝癌組織中低表達(dá)，且隨著臨床分期增加呈現(xiàn)表達(dá)降低趨勢(shì)（4期因只有6例數(shù)據(jù)，不具有可比性），見圖1。

圖1 TM 6SF2在肝癌中差異表達(dá)

2.2 TM 6SF2表達(dá)預(yù)后關(guān)系 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)可視化軟件KM-plotter分析TM6SF2不同表達(dá)肝癌患者5年生存曲線，結(jié)果表明低表達(dá)者生存期更短，見圖2［HR＝0.43（0.27～0.67），P＝0.000 13］。

圖2 TM 6SF2不同表達(dá)肝癌患者5年生存曲線

2.3 TM 6SF2過表達(dá)效率評(píng)價(jià) 成功構(gòu)建過表達(dá)TM6SF2穩(wěn)定細(xì)胞株Hep G2后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示空白組、對(duì)照組和過表達(dá)組TM6SF2／GAPDH蛋白表達(dá)灰度值分別為 0.256、0.263、0.999，過表達(dá)組TM6SF2蛋白表達(dá)升高約4倍，見圖3。

圖3 TM 6SF2過表達(dá)效率評(píng)價(jià)

2.4 過表達(dá)TM 6SF2對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖的影響 三組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示空白組、對(duì)照組和TM6SF2過表達(dá)組450 nm吸光度值分別為（0.84±0.06）、（0.82±0.07）、（0.52±0.04），經(jīng)單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝28.63，P＜0.05）；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞克隆數(shù)分別為（234±23.46）、（241±25.78）、（158±10.76）個(gè)，經(jīng)單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝14.33，P＜0.05），見圖4。

圖4 過表達(dá)TM 6SF2抑制Hep G2細(xì)胞增殖活性

2.5 過表達(dá)TM 6SF2對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC／PI雙標(biāo)記法檢測(cè)結(jié)果顯示空白組、對(duì)照組和TM6SF2過表達(dá)組細(xì)胞總凋亡率分別為（7.18±0.24）%、（7.12±0.14）%、（12.34±0.17）%，經(jīng)單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝253.9，P＜0.05），見圖5。

圖5 過表達(dá)TM 6SF2促進(jìn)Hep G2細(xì)胞凋亡能力

2.6 過表達(dá)TM 6SF2對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲的影響 Transwell法檢測(cè)結(jié)果顯示空白組、對(duì)照組和TM6SF2過表達(dá)組細(xì)胞侵襲數(shù)目分別為（157.30±2.91）、（159.70±3.18）、（91.33±4.63）個(gè)，經(jīng)單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝112.9，P＜0.05），見圖6。

圖6 過表達(dá)TM 6SF2抑制Hep G2細(xì)胞侵襲能力

2.7 TM 6SF2和SLC27A5在肝癌組織中表達(dá)正相關(guān) q-PCR在過表達(dá)TM6SF2細(xì)胞中檢測(cè)SLC27A5基因表達(dá)，結(jié)果表明SLC27A5高表達(dá)，見圖7A?；?5例肝癌組織檢測(cè) TM6SF2和SLC27A5表達(dá)，統(tǒng)計(jì)其表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果表明TM6SF2和 SLC27A5在肝癌組織中表達(dá)正相關(guān)（P＜0.05），見圖7B。

圖7 TM 6SF2和SLC27A5在肝癌組織中表達(dá)

3 討論

肝癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜發(fā)病過程，涉及諸多相關(guān)基因的異常表達(dá)。發(fā)現(xiàn)肝癌相關(guān)致病基因，并在研究其作用機(jī)制基礎(chǔ)上尋找治療新靶點(diǎn)是腫瘤生物學(xué)的重要內(nèi)容。TM6SF2已經(jīng)被證實(shí)參與脂質(zhì)代謝，與非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）和心血管疾病發(fā)生相關(guān)。近年研究報(bào)道，肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中存在TM6SF2基因失活突變現(xiàn)象。Stickel et al通過對(duì)751例酒精性肝硬化肝癌患者和1 165例酒精性肝硬化無(wú)肝癌患者進(jìn)行TM6SF2基因分型，使用多元邏輯回歸分析其與肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，結(jié)果表明攜帶TM6SF2 rs58542926是酒精性肝硬化患者發(fā)展HCC的危險(xiǎn)因素。Li et al回顧性分析839名中國(guó)漢族人口NAFLD和大腸腺瘤（CRA）病例進(jìn)行TM6SF2 rs58542926多態(tài)性基因分型，結(jié)果表明TM6SF2 rs58542926多態(tài)性與中國(guó)漢族人群NAFLD和NAFLD＆CRA的風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著關(guān)聯(lián)。TM6SF2 rs58542926 T等位基因可促進(jìn)NAFLD患者、NAFLD＆CRA患者脂質(zhì)分布和肝損傷的異常調(diào)節(jié)。

在肝癌發(fā)生發(fā)展中，TM6SF2最近才被認(rèn)為是一種抑癌因子，目前很少有TM6SF2與肝細(xì)胞肝癌發(fā)生機(jī)制及下游調(diào)控通路的研究報(bào)道，本研究通過過表達(dá)TM6SF2研究其在人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞中功能。首先，通過免疫組化及Western blot基于臨床組織水平和細(xì)胞水平檢測(cè)TM6SF2表達(dá)，結(jié)果均表明TM6SF2在肝癌中低表達(dá)。TCGA作為目前為止可以獲得的公開數(shù)據(jù)庫(kù)最全面的一個(gè)，其存儲(chǔ)了各類腫瘤的海量基因組數(shù)據(jù)和關(guān)聯(lián)臨床數(shù)據(jù)；基于TCGA分析TM6SF2表達(dá)，結(jié)果一致表明其在肝癌中低表達(dá)。基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)可視化軟件KM-plotter分析TM6SF2不同表達(dá)患者5年生存曲線，表明低表達(dá)者生存期更短。進(jìn)而，構(gòu)建過表達(dá)TM6SF2穩(wěn)定細(xì)胞株Hep G2，結(jié)果表明TM6SF2過表達(dá)可以降低Hep G2細(xì)胞增殖活性，侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)節(jié)的重要手段，又是機(jī)體免受腫瘤危害的重要保護(hù)機(jī)制，癌變的細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力通常極低，而增殖能力則相應(yīng)增強(qiáng)，這直接導(dǎo)致了瘤細(xì)胞快速而病態(tài)的分裂增殖，暗示TM6SF2可能通過促進(jìn)凋亡抑制腫瘤生長(zhǎng)。

此外，SLC27A5在過表達(dá)TM6SF2細(xì)胞中高表達(dá)，且基于肝癌組織臨床樣本TM6SF2和SLC27A5表達(dá)量，結(jié)果表明TM6SF2和SLC27A5在肝癌組織中表達(dá)正相關(guān)，暗示TM6SF2可能基于SLC27A5發(fā)揮作用。SLC27A5是SLC27A基因家族的成員，編碼FA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5（FATP5），該蛋白在肝臟中特異性表達(dá)，對(duì)脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)和膽汁酸代謝具有重要作用。SLC27A5在肝癌中作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。Gao et al發(fā)現(xiàn)SLC27A5在HCC中由于DNA甲基化過高而被下調(diào)表達(dá)，SCL27A5表達(dá)的降低則有助于腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后；功能獲得和缺失功能研究均表明SLC27A5在體外和體內(nèi)對(duì)HCC細(xì)胞具有抑制增殖作用。研究表明肝癌細(xì)胞中敲除SLC27A5會(huì)增加多不飽和脂質(zhì)，從而導(dǎo)致NADP／NADPH比增加、脂質(zhì)過氧化以及隨后的4-羥基-2-壬烯醛（4-HNE）積累，4-HNE修飾 KEAP1上的半胱氨酸殘基（Cys513、518），從而導(dǎo)致 KEAP1／NRF2途徑活化并增加NRF2靶基因（如TXNRD1）的表達(dá)水平。

綜上所述，本研究結(jié)果提示TM6SF2是一個(gè)重要的抑癌基因，具有抗腫瘤潛能，為HCC患者的腫瘤靶向治療提供理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)的HCC侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。