基于細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答觀察逐水飲治療肺癌胸腔積液療效及機制探究

何 婷,劉曉芳

(1.大連市中醫(yī)醫(yī)院，遼寧 大連 116013；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

惡性胸腔積液(Malignant pleural effusion,MPE)作為腫瘤進入晚期的惡病質(zhì)變現(xiàn)，是腫瘤患者的常見并發(fā)癥之一和主要死亡原因。MPE可來源于原發(fā)胸膜的惡性腫瘤，或是胸膜因肺癌、其他部位惡性腫瘤侵犯所導(dǎo)致。幾乎所有的惡性腫瘤均可引發(fā)MPE，其中肺癌是最常見的誘發(fā)病因，乳腺癌和淋巴瘤次之，上述常見的病因約占MPE的75%[1]。MPE的出現(xiàn)是危險信號提示，表明患者病情已經(jīng)進入晚期階段或腫瘤發(fā)生擴散，患者的預(yù)期壽命將明顯縮短。由于胸膜內(nèi)大量積液進行性的增加，使患者出現(xiàn)呼吸困難、胸部鈍痛、干咳等癥狀，不僅給患者帶來身體的痛苦也極大影響日常生活，若病情未能得到有效控制則會出現(xiàn)心肺衰竭而危及生命[2-3]。臨床上針對MPE有多種治療方法的選擇，但是藥物治療存在副作用或發(fā)熱、劇烈疼痛等問題，手術(shù)治療需要匹配適合的患者且面臨手術(shù)風(fēng)險。所以尋找可以緩解MPE患者臨床癥狀，盡量減少治療過程中給患者造成的痛苦，提高生活質(zhì)量及延長患者生存時間的治療方法是迫切需求的[4-5]。從中醫(yī)角度出發(fā)，MPE多屬“懸飲”范疇，癌毒侵襲機體，日益漸盛，人體正氣漸虛，氣血陰陽虧虛，津液輸布失常，水飲閉阻于胸肋乃致本病[6]。目前中醫(yī)藥治療MPE顯示出一定療效，故本研究構(gòu)建小鼠Lewis肺癌胸腔積液模型，采用中藥逐水飲進行干預(yù)，以期觀察基于細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答對模型小鼠的療效以及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及細胞株：本研究中的實驗動物均為清潔級雄性C57BL/6小鼠，共85只，在6～8周齡，體重范圍是16～24 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究所提供，動物使用許可證號SYXK(黑)2016004。飼養(yǎng)環(huán)境如下：溫度和相對濕度分別保持在21～25 ℃和50%～60%，每日對飼養(yǎng)室適當(dāng)通風(fēng)換氣，保持晝夜各12 h。小鼠Lewis肺癌瘤株購自上海心語生物科技有限公司。

1.1.2 實驗藥物與試劑：逐水飲是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院在臨床治療MPE的經(jīng)驗總結(jié)藥方，具體組成如下：黃芪、葶藶子、白花蛇舌草各20 g，豬苓、茯苓、桑白皮、莪術(shù)各15 g，甘草12 g，大棗、浙貝母、麥冬各10 g。上述所有藥材在純凈水中浸泡30 min，使用5倍水量進行煎煮，共煎煮2次，過濾后將所有藥液混合在一起，通過蒸發(fā)將藥液濃縮成1 g生藥/ml藥液，存放于4 ℃冰箱中待后續(xù)使用。順鉑注射液由杭州民生藥業(yè)集團有限公司提供。小鼠Lewis肺癌瘤株，購自上海心語生物科技有限公司；胎牛血清，購自HyClone公司；小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒購自Abcam公司(批號 ab86349)；小鼠CTLA-4的ELISA試劑盒購自Abcam公司(批號 ab255720)。

1.1.3 實驗儀器：電熱恒溫水浴鍋(型號：DZKW-D-2)購自黃驊光明實驗儀器設(shè)備有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱(型號：ICA175)購自北京安捷來勒科技有限公司；培養(yǎng)用倒置生物顯微鏡(型號：NIB620)購自寧波永新光學(xué)股份有限公司；精密天平(型號：FA3204B)購自上海天美天平儀器有限公司；流式細胞儀(型號：CytoFLEX)購自貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立：本研究構(gòu)建的胸腔積液小鼠模型參考Theodora等[7]和周愷驊等[8]實驗研究并且加以改良。首先進行細胞的復(fù)蘇，將裝有Lewis肺癌細胞的凍存管置于37 ℃恒溫水浴鍋中迅速融化，吸取細胞懸液于15 ml離心管中，加入10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，然后進行1000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5 min，棄上清液，加2 ml的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基將細胞均勻吹散，培養(yǎng)基加至10 ml，置于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h后進行換液。細胞生長到80%～90%融合時進行傳代，2～3 d傳代1次。收集處于對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細胞且臺盼蘭試驗測定細胞活性>90%，將細胞濃度調(diào)整至5.0×106/ml。接種前將85只小鼠右側(cè)胸部皮膚進行消毒，隨機選取68只小鼠在其右側(cè)胸部近腋中線，大約與第6肋間隙持平的位置進行上述細胞懸液的胸腔注射，接種量為經(jīng)過PBS調(diào)整濃度為2.5×106/ml的細胞懸液0.2 ml。

1.2.2 實驗動物分組與給藥：將這68只模型小鼠隨機分四組，分別為模型組、逐水飲組、順鉑組、逐水飲聯(lián)合順鉑組，各17只；剩余17只小鼠相同位置予0.9%氯化鈉溶液進行胸腔注射，為空白參照組。空白參照組常規(guī)方式喂養(yǎng)，不給予干預(yù)方法。68只模型組Lewis肺癌細胞胸腔積液模型小鼠造模第4 天開始進行藥物干預(yù)，模型組不給予藥物干預(yù)。逐水飲組：小鼠的給藥量為33.5 g/(kg·d)的中藥逐水飲藥液，給藥體積為0.2 ml，1次/d。順鉑組：先將用9 L的0.9%生理鹽水將順鉑注射液進行稀釋6 mg/(kg·d)的標(biāo)準(zhǔn)予小鼠腹腔注射，給藥次數(shù)為每3天1次。逐水飲聯(lián)合順鉑組：27 g/(kg·d)中藥逐水飲藥液，以2 ml灌胃體積給藥，1次/d，同時合用腹腔注射6 mg/(kg·d)順鉑，每3天1次。建立模型當(dāng)天為第1、4天開始給藥干預(yù)，每一組的給藥時間均為10 d。

1.2.3 實驗動物取材：建立模型的第14天開始取材，每組取出10只小鼠，行眼球取血，使用肝素抗凝，另取血樣1 ml室溫放置2 h后進行離心(2000 r/min)，收集血清存放于-80 ℃。同時解剖小鼠收集MPE，測量并記錄MPE體積。各組剩余的7只小鼠用于生存期的觀察。

1.2.4 實驗動物MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)以及生存天數(shù)：MPE體積、生存期上文已描述方法。胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)采用解剖顯微鏡進行觀察，兩位實驗人員分別獨立觀察并記錄小鼠前、側(cè)、后胸壁的轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)。

1.2.5 實驗小鼠外周血Th17、Treg細胞的流式檢測：取各組小鼠的肝素抗凝外周血100 μl，Th17、Treg分別進行相應(yīng)同型抗體的染色，如下：CD4-FITC、IL-17A-PE、CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE染色，嚴格按照說明書要求操作，最后在流式細胞儀進行檢測。

1.2.6 ELISA測定小鼠外周血中TGF-β1以及CTLA-4含量：取保存于-80 ℃的血清樣本，分別嚴格依據(jù)小鼠TGF-β1試劑盒和小鼠CTLA-4試劑盒的操作步驟對指標(biāo)進行測定。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)以及生存天數(shù)比較 通過10 d的藥物干預(yù)后，各組小鼠的MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)以及生存期均有變化。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組、逐水飲聯(lián)合順鉑組小鼠的MPE體積均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組、逐水飲聯(lián)合順鉑組小鼠的胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組、逐水飲聯(lián)合順鉑組小鼠的生存天數(shù)均延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與順鉑組比較，逐水飲組在MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)以及生存期方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與逐水飲組、順鉑組比較，逐水飲聯(lián)合順鉑組在MPE體積的減少、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)的減少以及生存期方面，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)以及生存天數(shù)比較

2.2 各組小鼠外周血Th17、Treg細胞數(shù)量變化情況比較 與空白參照組比較，其他各組小鼠Th17細胞數(shù)量均高，逐水飲組、順鉑組、逐水飲聯(lián)合順鉑組的Th17細胞數(shù)量與模型組比較均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且逐水飲聯(lián)合順鉑組升高程度最大。順鉑組Th17細胞數(shù)量與逐水飲組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與逐水飲組、順鉑組比較，逐水飲聯(lián)合順鉑組Th17細胞數(shù)量均高于這兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組Treg細胞數(shù)量均高于空白參照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組、逐水飲聯(lián)合順鉑組的Treg細胞數(shù)量均低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組Treg細胞數(shù)量與逐水飲組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；逐水飲聯(lián)合順鉑組Treg細胞數(shù)量均低于逐水飲組、順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠外周血Th17、Treg細胞數(shù)量比較(%)

2.3 各組小鼠外周血中TGF-β1、CTLA-4含量比較 與空白參照組比較，其他各組的TGF-β1水平均有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且模型組升高程度最大。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組、逐水飲聯(lián)合順鉑組的TGF-β1水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。順鉑組TGF-β1水平與逐水飲組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。逐水飲聯(lián)合順鉑組TGF-β1水平均低于逐水飲組、順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白參照組比較，其余各組的CTLA-4水平均有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，且模型組升高程度最大。逐水飲組、順鉑組、逐水飲聯(lián)合順鉑組的CTLA-4水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。順鉑組CTLA-4水平與逐水飲組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。逐水飲聯(lián)合順鉑組CTLA-4水平低于逐水飲組、順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠外周血中TGF-β1、CTLA-4含量及比較

3 討 論

MPE是胸膜受到惡性腫瘤的侵害而引發(fā)胸膜腔液異常增多及集聚，惡性腫瘤可以是原發(fā)性的也可是肺癌、乳腺癌等其他部位的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至胸膜[9]。MPE作為晚期惡性腫瘤的常見且難以控制的并發(fā)癥，在全部胸腔積液中的比例可以達到18%～32%。相關(guān)調(diào)查統(tǒng)計我國每年有MPE患者20萬左右，在全部胸腔積液患者中的比例大約為40%[10-11]。胸腔處積液的集聚以及迅速發(fā)展壓迫肺組織，會機械性限制肺擴張，直接影響心肺功能或肺部因引流不暢而導(dǎo)致感染，所以常造成患者呼吸功能障礙、循環(huán)障礙等。臨床中患者一旦出現(xiàn)MPE，則是疾病進入晚期的標(biāo)志，此時有效減緩積液增長、改善呼吸困難、胸悶、胸痛等臨床癥狀、在延長患者生存時間的同時提高患者的生活質(zhì)量是治療的首要任務(wù)[12-13]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)從調(diào)節(jié)機體免疫功能、調(diào)控免疫炎癥微環(huán)境、促進胸膜黏連等多途徑對MPE進行干預(yù)，在療效和安全性方面也呈現(xiàn)出鮮明的優(yōu)勢。可以作為晚期腫瘤、體弱年老，尤其不能接受手術(shù)治療等患者的首選治療方法[14]。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)根據(jù)MPE的病位和臨床表現(xiàn)將其歸屬于“懸飲”，《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》中曾有記載“飲后水流脅下，咳唾引痛”該描述正與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的MPE的病位和癥狀相似。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為正氣虛衰是MPE的發(fā)病根本，邪毒侵犯是致病因素。正氣虛弱則氣血陰陽失和，津液輸布不暢，水液集聚為懸飲，或正虛易感邪毒，與停聚的水液相互搏結(jié)，阻塞三焦水道，乃成本病[15-16]。對于MPE的中醫(yī)治療要重視祛邪和扶正同時兼顧。本研究中應(yīng)用的中藥處方逐水飲是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院在臨床治療MPE的經(jīng)驗方。方中黃芪善于補脾益氣，葶藶子、桑白皮有瀉肺平喘、利水之功效，白花蛇舌草可以解毒抗腫瘤，豬苓、茯苓可淡利水濕，茯苓又有健脾補中之功，莪術(shù)長于行氣活血，暢通血脈，使水液通道順暢又可抗癌，浙貝和麥冬長于養(yǎng)陰潤肺，大棗有扶正調(diào)和之功，防止方內(nèi)諸藥克耗正氣，甘草意在調(diào)和諸藥。全方健脾、行氣、活血、利水、抗癌又兼顧扶正[17-18]。本次研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，逐水飲組、順鉑組以及逐水飲聯(lián)合順鉑組MPE體積均減少、胸壁轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)均減少、生存天數(shù)均延長，表明中藥處方逐水飲和順鉑在抑制MPE生成和腫瘤生長方面均有一定的效果，且逐水飲聯(lián)合順鉑組在這些方面的改善情況均優(yōu)于單獨使用逐水飲和單一使用順鉑，表明逐水飲配合順鉑同時使用對MPE的治療效果更加顯著。李政等[19]在晚期非小細胞肺癌伴惡性胸水的患者治療中將葶藶甘遂逐水飲應(yīng)用其中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于單純應(yīng)用胸腔內(nèi)灌注化療，聯(lián)合葶藶甘遂逐水飲能夠更好的改善患者癥狀，有效抑制胸水的生成。本研究結(jié)果與李政等研究結(jié)果基本一致。

腫瘤細胞的局部微環(huán)境是密切參與MPE從生成到發(fā)展過程的，且免疫細胞是重要部分。CD4+T細胞和CD8+T細胞主要介導(dǎo)機體的免疫細胞，而Th17細胞是發(fā)現(xiàn)于CD4+T細胞的新效應(yīng)性細胞亞群。正常生理狀態(tài)下，Th17細胞和Treg細胞應(yīng)處于平衡狀態(tài)，已有研究證實Th17細胞和Treg細胞與MPE的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[20-21]。王兵等[22]發(fā)現(xiàn)Lewis肺癌MPE的模型小鼠外周血Th17細胞水平降低而Treg細胞水平升高，出現(xiàn)了Th17/Treg失衡。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，逐水飲組、順鉑組以及逐水飲聯(lián)合順鉑組的Th17細胞表達均有升高，Treg細胞表達均降低，其中逐水飲聯(lián)合順鉑組的Th17升高、Treg下降變化最明顯，提示模型組小鼠免疫功能受損，由Th17細胞占優(yōu)勢轉(zhuǎn)向Treg細胞的高表達，使Th17/Treg平衡受到破壞，而使用中藥逐水飲、順鉑進行干預(yù)均可以糾正Th17/Treg失衡，逐水飲聯(lián)合順鉑同時干預(yù)效果更優(yōu)。TGF-β對于調(diào)節(jié)初始CD4+T細胞分化有著關(guān)鍵作用，且CD4+T細胞向Th17細胞分化或者向Treg細胞分化依賴于TGF-β的表達濃度[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，逐水飲組、順鉑組以及逐水飲聯(lián)合順鉑組的TGF-β表達均降低，其中逐水飲聯(lián)合順鉑組的TGF-β表達降低最顯著。提示中藥逐水飲、順鉑進行干預(yù)均使TGF-β低表達，從而誘導(dǎo)CD4+T細胞向Th17方向分化，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)進而治療MPE，逐水飲聯(lián)合順鉑治療效果更優(yōu)。CTLA-4會抑制T細胞的激活；通過刺激TGF-β的分泌會導(dǎo)致T細胞增殖途徑受阻；抑制細胞因子的產(chǎn)生,抑制T細胞的增生，這些機制會增強腫瘤的耐受性，使機體的抗腫瘤能力降低[24]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，逐水飲組、順鉑組以及逐水飲聯(lián)合順鉑組的CTLA-4水平均降低，其中逐水飲聯(lián)合順鉑組的CTLA-4水平降低最顯著。提示使用中藥逐水飲、順鉑可以有效抑制CTLA-4表達，改善機體免疫功能，抑制腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。周立云等[25]對于惡性胸水患者，在治療組加用了自擬扶正逐水飲，結(jié)果顯示與對照組相比，加用自擬扶正逐水飲在控制胸水和改善患者免疫功能方面均取得了更好效果，與本研究結(jié)果相似。

綜上所述，中藥逐水飲通過使Th17細胞高表達、Treg細胞低表達及調(diào)控相關(guān)細胞因子使Th17/Treg達到平衡狀態(tài)，增強機體免疫功能，糾正免疫缺陷，抑制癌細胞逃逸，以此緩解胸腔積液情況，且逐水飲聯(lián)合順鉑治療效果更顯著。