越冬期間水體氨氮對紅螯螯蝦生理功能的影響研究

程 順，韋永春，李 飛，遲美麗，賈永義，劉士力，鄭建波，顧志敏

(浙江省淡水水產研究所，農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江省淡水水產遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001)

紅螯螯蝦又名澳洲淡水龍蝦，比普通蝦生長速度快、規格大、出肉率高，且膽固醇含量僅為普通蝦的70%，是一個具有較高增養殖潛力且深受消費者青睞的品種。在21 世紀初，浙江省淡水水產研究所從澳大利亞引進紅螯螯蝦，并進行了親蝦培育、人工越冬等一系列研究，為室內規模化苗種繁育的開展打下了基礎。但目前蝦苗批量化供應能力的不足及蝦苗價格過高等瓶頸阻礙著紅螯螯蝦市場的擴大，造成這一現狀的原因之一是紅螯螯蝦親蝦在室內越冬過程中進行室內小水體培育，環境的變化極易影響水質指標，進而造成親蝦體質的下降及生長與繁殖的受限。

在紅螯螯蝦親蝦室內越冬過程中，水體中的氨氮主要由殘餌、蝦體排泄物等含氮有機物分解產生，是主要的脅迫因子之一。目前大部分的研究關注氨氮急性脅迫下蝦的成活率，可是在實際生產中一般氨氮不會達到致死的濃度，而低于致死濃度的氨氮也會對蝦的生長與存活產生影響，這是由于機體在受到氨氮連續刺激且超過機體調節閾值時，其抗氧化系統遭到破壞、組織結構發生病變所致。因此，必須在探討氨氮致死濃度的同時，分析氨氮對組織器官的損傷及對抗氧化指標、免疫相關指標、能量代謝指標的影響，以便更好地指導實際生產中的水質管理，改善親本在越冬期間的生長狀況。

一般紅螯螯蝦親蝦從外塘移入溫室初期，氨氮會達到0.4 毫克/升左右，需要經過一段時間才能穩定在0.2 毫克/升以下。因此，本試驗在確定氨氮脅迫下螯蝦96 小時半致死濃度和安全濃度后，分別設置空白對照、低濃度、中濃度和高濃度氨氮試驗組，同時結合組織切片、酶活性檢測方法分析肝胰腺結構以及相關抗氧化指標、免疫相關指標、能量代謝指標變化，從組織和生理生化水平探討氨氮脅迫對紅螯螯蝦的影響，旨在為紅螯螯蝦親蝦越冬及生態養殖過程中的水質管理提供科學依據。

一、材料與方法

1.試驗材料

試驗用蝦均采自浙江省淡水水產研究所綜合試驗基地，選取越冬期間體色正常、健康活潑、規格相近的紅螯螯蝦親蝦。

2.試驗方法

采用常規生物急性毒性試驗法，研究0～200毫克/升氨氮濃度對紅螯螯蝦親蝦的急性毒性，得到24～96 小時的死亡率，并通過概率單位法計算半致死濃度以及安全濃度。然后結合紅螯螯蝦親蝦越冬的生產實際，分別設置對照組(0 毫克/升)和低濃度(0.4 毫克/升)、中濃度(1.0 毫克/升)、高濃度(2.0 毫克/升)3 個試驗組，每組設置3個平行。用分析純氯化銨試劑配制試驗組總氨氮濃度。挑選紅螯螯蝦親蝦隨機移入水槽中。試驗期間停止投餌，并每隔12 小時進行換水及總氨氮濃度監測，使總氨氮濃度穩定，水溫為(22±1)℃，24小時連續微充氣以保證溶氧充足。

氨氮脅迫96 小時后采集樣品。每次從各組水槽中隨機取螯蝦的肝胰腺并保存于波恩氏液及液氮中。波恩氏液保存的樣品常規石蠟包埋，連續橫切，切片厚度為6微米，HE染色，顯微鏡觀察并拍照。液氮保存的樣品之后轉移至-80℃超低溫冰箱保存。按每克待測樣組織加入9毫升生理鹽水的比例配制組織勻漿，研磨后轉移至離心管中，4℃下以3 000 轉/分離心10 分鐘，取上清液分裝后放入4℃冰箱暫存，用于測定抗氧化指標如超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、免疫相關指標如酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活性，測定能量代謝指標如甘油三酯(TG)水平。酶活指標均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

3.數據處理

試驗數據分析采用Excel、SPSS進行處理，統計結果以平均值與標準差(X±SD)表示。

二、結果

1.氨氮脅迫急性毒性試驗

采用常規生物急性毒性試驗法研究氨氮對紅螯螯蝦96 小時的半致死濃度以及安全濃度，結果顯示紅螯螯蝦的死亡率隨氨氮濃度及脅迫時間的增加而增加。同時，通過SPSS 的概率單位法計算得到氨氮對紅螯螯蝦96 小時的半致死濃度為56.84毫克/升，安全濃度(SC)為5.68毫克/升。

此外，筆者發現在氨氮高于50毫克/升的條件下，死亡前的紅螯螯蝦首先是活力減弱，有時身體向后上方急退，然后失去平衡，四肢無力，最后側臥于水底，隨即死亡。

2.氨氮脅迫對肝胰腺組織學的影響

組織切片觀察發現，對照組上皮細胞無斷裂，排列整齊，分支管狀腺之間的結締組織較多而互相聯系；低濃度組(0.4 毫克/升)與對照組形態一致，也未出現形態學的改變；中濃度組(1.0 毫克/升)的肝小管排列開始混亂，各肝小管大小出現差異，肝小管間距離變大，但總體上變化不明顯；高濃度組(2.0 毫克/升)肝小管的整體結構出現變化，即肝小管排列混亂，各肝小管大小出現差異，基膜變得不整齊，肝小管間的結締組織減少，細胞出現裂解，產生空泡化。總體上，在96 小時內，隨著氨氮質量濃度的增加，紅螯螯蝦肝胰腺內的肝小管排列趨于混亂，大小出現差異，肝小管間的結締組織也隨之減少，細胞出現裂解，產生空泡化，在高濃度組(2.0 毫克/升)中的變化相對明顯。因此，中濃度氨氮(1.0毫克/升)對蝦的肝胰腺造成了輕微損傷，高濃度氨氮(2.0毫克/升)對蝦的肝胰腺造成了較大的損傷。

3.氨氮脅迫對肝胰腺內酶活力的影響

酶活檢測結果表明，在氨氮為0～2.0毫克/升范圍內，抗氧化指標SOD 活性為33.77～38.08 單位/毫克，且隨氨氮質量濃度的升高而降低，其中氨氮為1.0～2.0 毫克/升組的SOD 值顯著低于氨氮為0 毫克/升的對照組(P＜0.05)；而MDA 則相反，為1.73～2.20單位/毫克，且隨氨氮質量濃度的升高而升高，其中高濃度氨氮組(2.0毫克/升)的MDA值顯著高于其他3 組(P＜0.05)(表1)。在氨氮為0～2.0 毫克/升范圍內，免疫相關指標ACP 值為84.89～119.16 單 位/毫 克 、 AKP 值 為 25.87～80.17 單位/毫克，且均隨氨氮質量濃度的升高而降低，4個氨氮組的ACP、AKP值均呈顯著差異(P＜0.05)，高濃度氨氮組(2.0 毫克/升)的值最低(表2)。在氨氮為0～2毫克/升范圍內，能量代謝指標TG值為0.16～0.23毫摩/克，且隨氨氮質量濃度的升高而降低，但4 個氨氮組的TG 值無顯著差異(P＞0.05)(表3)。除MDA 外，總體上抗氧化能力、免疫相關指標及能量代謝相關指標均隨氨氮質量濃度的升高而降低，高濃度氨氮組(2.0 毫克/升)的抗氧化能力、免疫相關指標及能量代謝相關指標最低。中濃度氨氮組(1.0 毫克/升)及高濃度氨氮組(2.0 毫克/升)的 SOD 值、ACP 值、AKP 值顯著低于對照組(0毫克/升)(P＜0.05)，高濃度氨氮組(2.0 毫克/升)的 MDA 值、ACP 值、AKP 值顯著低于其他3組(P＜0.05)。

表1 抗氧化指標檢測情況

表2 免疫相關指標檢測情況

表3 能量代謝指標檢測

三、分析與討論

紅螯螯蝦對氨氮有較強的耐受力，其96 小時半致死濃度為56.84 毫克/升，安全濃度為5.68 毫克/升。這要高于對蝦類及沼蝦類，與克氏原螯蝦接近，說明紅螯螯蝦有在水質條件較差的環境中生存的能力。可是在紅螯螯蝦親蝦越冬過程中，氨氮的異常升高仍是一個重要的脅迫因子，因為當氨氮達到一定質量濃度時，紅螯螯蝦雖然不會死亡，但對其生長、蛻殼、攝食、繁殖、體質等都會產生影響。呂曉燕等(2010)認為氨氮要嚴格控制在一定范圍內，以防氨氮脅迫對紅螯螯蝦機體的損害，因為氨氮脅迫不僅會引起蝦體的中毒，也會嚴重降低蝦的免疫力與抗病力。根據急性毒性試驗中蝦臨死前的中毒表現，筆者猜測氨氮對紅螯螯蝦體內器官及生理生化水平均產生了負面影響。于是筆者在氨氮為0～2毫克/升范圍內進行了肝胰腺組織切片的觀察、抗氧化指標及免疫指標的檢測，并認為紅螯螯蝦在一定質量濃度的氨氮環境下，其器官功能、抗氧化能力、免疫能力等均會產生變化。

首先，高氨氮導致的肝胰腺的生理功能受損是使蝦生命力降低的重要原因。通過組織切片觀察，肝小管上皮細胞的排列變得混亂，在中、高氨氮組，尤其在高氨氮組，細胞出現裂解，產生空泡化，證明了氨氮對肝胰腺的組織結構有損害，若長期處于此環境條件下，將影響其生理功能而致肝胰腺病變，進而破壞機體的新陳代謝，制約其越冬期間的生長及繁殖。

其次，不同氨氮條件下，紅螯螯蝦體內的抗氧化及免疫指標不同，從而導致蝦的體質下降。本次研究表明，紅螯螯蝦的抗氧化指標、免疫相關指標及能量代謝相關指標均隨氨氮質量濃度的升高而降低，其中高濃度氨氮組(2 毫克/升)的抗氧化能力、免疫相關指標均顯著低于對照組(0 毫克/升)。有研究表明，在脅迫條件下，蝦通過調節體內SOD 活性，從而減輕超氧化物自由基的損害，抑制脂質過氧化產物的積累，保護細胞免受氧化損傷。本試驗結果顯示，在氨氮為0～2毫克/升范圍內，抗氧化指標SOD活性隨氨氮質量濃度的升高而降低，而MDA則相反，隨氨氮質量濃度的升高而升高，其中氨氮為1～2 毫克/升的SOD 值顯著低于無氨氮脅迫組(P＜0.05)，氨氮為2毫克/升組的MDA 值顯著高于其他組(P＜0.05)。因此，氨氮對紅螯螯蝦抗氧化系統有影響，這種損傷隨著氨氮質量濃度的升高而加劇。本次研究與蘆光宇等(2014)的研究結果相一致，即抗氧化酶活性隨著氨氮脅迫水平增加表現出先激活后抑制的趨勢，說明抗氧化酶既可因污染的暴露而產生適應性誘導反應，也可因污染的毒性作用而產生中毒反應，并推測這是造成紅螯螯蝦器官損傷的重要原因。ACP 和AKP 的活性變化能夠一定程度指示機體的免疫狀況。蔣琦辰等(2013)在對紅螯螯蝦的氨氮脅迫研究中發現，3 天脅迫后隨著氨氮的升高，其活性的變化相似，高質量濃度組ACP及AKP的值都顯著降低，并認為高氨氮脅迫能抑制免疫相關酶的活性，對免疫系統造成損害。本試驗結果表明，4 個組的 ACP、AKP 值均差異顯著(P＜0.05)，其中氨氮濃度為2 毫克/升組的值最低，因此筆者認為紅螯螯蝦機體的免疫力隨氨氮質量濃度的升高而降低。

在進行紅螯螯蝦親蝦室內越冬時需要對水質進行定期監測，避免氨氮過高而影響機體的正常功能。當氨氮不穩定或突然升高時，必須進行針對性應對，當氨氮超過0.4 毫克/升，甚至超過1 毫克/升時，建議進行以下操作：首先是立即換水，快速降低氨氮質量濃度；其次，鑒于過高氨氮會導致機體抗氧化指標、免疫相關指標等的變化，可潑灑應激靈、免疫增強劑等產品，以降低親蝦的應激反應，保持親蝦生理生化指標的穩定；第三，鑒于過高氨氮會導致機體免疫力的降低及肝胰腺的損傷，可在投喂的飼料中摻入大蒜素、螺旋藻粉、多礦寶等提高機體免疫力及護肝的產品，以增強親蝦的抗病力及維持肝胰腺等臟器的正常工作；最后，可在水中加入EM 菌等進行調水，以穩定水質，避免氨氮再次升高。長期穩定、正常的氨氮質量濃度將有助于提高紅螯螯蝦親蝦的越冬成活率，并維護親蝦的體質，是親蝦順利完成室內越冬的基礎條件。