高效液相色譜法測定浸鈾酸液中7種有機酸

李文娟，劉莎莎，徐玲玲，龔 甜

(東華理工大學水資源與環境工程學院，江西 南昌 330013)

微生物溶浸是近年來新興起的一門技術。微生物浸鈾具有工藝簡單、原料消耗少、成本低、能夠將難浸及低品位礦床浸出率提高的特點，微生物溶浸可強化浸出過程并改善鈾浸出動力學，特別是對于低品位難浸鈾礦在提高鈾浸出率、降低生產成本等方面具有獨特優勢[1-2]。異養型浸礦微生物的浸礦機制主要是通過產生有機酸等代謝產物，與礦石發生酸解、氧化還原或絡合作用，最終實現鈾的浸出，部分細菌還可以吸附在鈾礦表面與鈾礦發生直接作用[3]。本研究是以土豆淀粉等為原料，產生代謝物各種小分子有機酸與鈾礦作用，從而達到溶浸出鈾的目的。實驗過程中產生的有機酸采用高效液相色譜法測定。

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

Agilent1260高效液相色譜儀；Agilent色譜工作站；Milli-Q7000超純水器(出水電阻大于18 MΩ)，德國默克；SB-5200D超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份公司。

乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)。除L-乳酸的純度為86%外，其余標準品純度均>99%，20 mmol NaH2PO4-H3PO4緩沖液(pH=2.0，真空抽濾)。實驗中所用標準品，草酸(1 L 0.1 N標準溶液)，ACROS(品牌)，北京伊諾凱科技有限公司；L-蘋果酸(100 mg)，中檢所，北京伊諾凱科技有限公司；L-乳酸(100 mL)，VETEC；α-酮戊二酸(20 mg)，北京盛世康普化工技術研究院；檸檬酸(250 mg)，Aladdin，北京伊諾凱科技有限公司；琥珀酸(1 g)，Aladdin，北京伊諾凱科技有限公司；富馬酸(20 mg)，北京盛世康普化工技術研究院。

1.2 微生物樣品的采集和制備

在土豆蔗糖培養基中，接種約含有6.5×105 spores的孢子懸浮液，然后在25 ℃，頻率為200 r/min的條件下，震蕩培養黑曲霉60 h后取其代謝液1 mL，過濾去除菌絲，并用流動相稀釋100倍，最后過0.22 μm濾膜。

1.3 色譜條件

色譜柱：美國Zorbax SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；

保護柱：美國USHXB13566(4.6 mm×50 mm，5 μm)；

流動相：20 mmol NaH2PO4-H3PO4緩沖液，pH=2.0；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：30 ℃；

進樣體積：20 μL；

理論塔板數：按40 μg/mL奈計為16000。結果見圖1；

紫外檢測波長：210 nm。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

有機酸是一類重要的有機化合物，在大多數反相液相色譜(RPLC)條件下，有機酸很難保留，而離子抑制色譜法的應用(ISC)是一個提高保留率和選擇性的方便而直接的方法。在ISC下，淋洗液的pH值必須在2左右低于分析物酸的pKa值，在這種條件下，酸是分子形式的，可保留和分離。本研究所采用的RPLC ZORBAX SB Aq柱采用大體積側鏈的使用顯著改善了柱/鍵合相，所以此柱在酸性洗脫條件下能應用在完全含水的溶液中。用40 μg/mL的奈測定色譜柱的柱效見圖1，萘的保留時間為5.564 min，與此柱出廠時安捷倫公司測定的5.600 min相差0.036 min，且分離度良好，可見RPLC ZORBAX SB-Aq柱柱效良好。

圖1 40 μg/mL奈的HPLC色譜圖

2.1.2 流動相及其濃度的選擇

選擇流動相是高效液相色譜分析的重要步驟，常用的流動相有甲醇溶液，乙腈溶液和磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液是反相色譜柱上應用較廣的流動相。根據測定對象是微生物代謝產物有機酸，經過比較大量的有機酸測定譜圖，本研究著重選擇了80%的甲醇-水溶液，80%的乙腈-水溶液，99%的磷酸鹽緩沖液-1%的乙腈溶液，及100%的磷酸鹽緩沖液作流動相比較分離情況，見圖2～圖5。

圖2 80%的甲醇水溶液為流動相測定七種有機酸的標準HPLC色譜圖

圖3 80%的乙腈水溶液為流動相測定七種有機酸的標準HPLC色譜圖

圖4 99%的磷酸鹽緩沖液和1%的乙腈溶液為流動相測定七種有機酸標準的HPLC色譜圖

圖5 100%的磷酸鹽緩沖液為流動相測定七種有機酸的標準HPLC色譜圖

結果表明，以磷酸鹽緩沖液為流動相時，能較好地分離7種有機酸，所以選擇磷酸鹽緩沖液為流動相。磷酸二氫鈉溶液的濃度直接影響流動相的穩定性，從而影響色譜柱分離效果。通過比較發現，20，35和40 mmol/L的3種不同濃度磷酸鹽緩沖液為流動相時，對7種有機酸都能得到很好的分離效果。由于高濃度的鹽溶液，增加流動相的本底吸收、降低靈敏度，影響分離效果，并縮短色譜柱壽命。因此選擇濃度20 mmol/L NaH2PO4-H3PO4緩沖液(pH=2)為流動相。

2.1.3 流動相流速的選擇

用濃度為20 mmol/L的磷酸二氫鈉緩沖液做為流動相測定七種有機酸混標，其流速為0.8、1.0、1.5、2.0 mL/min時，得到的分離情況見圖6～圖9。

圖6 流速為0.8 mL/min時測定有機酸的標準HPLC色譜圖Fig.6 The HPLC chromatogram of standard mixture of seven organic acids with 0.8 mL/min圖7 流速為1.0 mL/min時測定有機酸的標準HPLC色譜圖Fig.7 The HPLC chromatogram of standard mixture of seven organic acids with 1.0 mL/min圖8 流速為1.5 mL/min時測定有機酸的標準HPLC色譜圖Fig.8 The HPLC chromatogram of standard mixture of seven organic acids with 1.5 mL/min圖9 流速為2.0 mL/min時測定有機酸的標準HPLC色譜圖Fig.9 The HPLC chromatogram of standard mixture of seven organic acids with 2.0 mL/min

實驗結果表明：在不同流速下，7種有機酸都能得到很好的分離，當流速過小時分離時間會延長，流速過大又會引起柱壓的升高，因此本研究在有機酸樣品能得到較好分離的前提下，選擇1.0 mL/min作為流動相的流速。

2.2 精密度實驗

在選定色譜條件下，測定7種有機酸的保留時間和峰面積的精密度見表1。七種組分保留時間的RSD分別為0.28%、0.12%、0.14%、0.05%、0.19%、0.03%、0.14%，均小于0.3%，表明精密度良好。

表1 7種有機酸保留時間的相對標準偏差

表2 7種有機酸峰面積的相對標準偏差

標準樣品在一個濃度進樣5次的條件下，7種有機酸組分峰面積的RSD分別為0.42%、1.60%、1.79%、0.84%、0.24%、2.09%、0.12%，小于2.1%，表明精密度良好。

2.3 標準曲線及線性度

標準溶液的配制：分別準確稱取標準品L-蘋果酸0.1341 g、α-酮戊二酸0.1461 g、檸檬酸0.1921 g、琥珀酸0.1181 g、富馬酸0.1161 g，溶解并用流動相(99%的20 mmol/L磷酸緩沖液(pH=2)+1%的乙腈)定容至10 mL的容量瓶中，配成0.1 mol/L的標準儲備液；草酸直接使用購買的0.05 mol/L的標準儲備液；稱量10 g的乳酸標準貯備液稀釋至10 mL的容量瓶中配成860 mg/L的標準儲備液。將標準貯備液置于4 ℃冰箱中保存，使用時用流動相稀釋成所需濃度[4]，具體濃度見表3。

表3 7種有機酸標準濃度系列

打開高效液相色譜儀，平衡50 min后，按照選定的色譜條件將表3中的5個混合標準液依次進樣分析，得到其相關系數和回歸方程，見表4，結果表明：7種組分在其質量濃度范圍內線性關系良好。標樣譜圖見圖10。

表4 7種有機酸的保留時間、相關系數、回歸方程

圖10 7種有機酸標準液譜圖

2.4 樣品的測定

2.4.1 加標回收

根據微生物浸鈾的各個階段浸出液樣中含有不同成分來模擬實際樣品并稀釋100倍，在稀釋后的樣品中準確加入一定量的7種有機酸標液，混勻，經過0.22 μm濾膜真空過濾[5]，在相同的色譜條件下進樣，直接進樣測定5次，根據線性方程得到樣品的有機酸含量，計算加標回收率[6]，其加標回收率為96.0%～109.3%(見表5)。

表5 加標回收率

2.4.2 實際樣品的測定

準確移取pH值為1.66、1.81、2.11的土豆培養基代謝液，用于浸取鈾礦的黑曲霉代謝產生的有機酸液1 mL，并稀釋100倍，過0.22 μm濾膜[7-8]，在上述“1.3色譜條件”下進樣，得到各個有機酸的含量見表6。

表6 7種有機酸的含量

4 結 論

研究建立了高效液相色譜-紫外檢測法測定浸鈾酸液中7種有機酸的方法，包括色譜柱的選擇，流動相種類及流速的選擇，該方法對鈾浸出液中的有機酸能夠有效的進行分析，可以廣泛的應用于微生物浸礦酸液中有機酸的檢測。