基于離子液體微波輔助萃取牡丹皮中丹皮酚的含量測(cè)定*

吳 晟

(安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，安徽 蕪湖 241000)

牡丹是芍藥科(Paeoniaeeae)芍藥屬(Paeonia)植物，主要分布在安徽、山東、四川等地。牡丹皮是牡丹的干燥根皮[1]，為臨床常用中藥之一。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)：牡丹皮中含有17種單萜類成分、11種鞣質(zhì)成分、8種酚酸類成分等48種成分[2]，其中的丹皮酚在臨床上多用于治療風(fēng)濕痛、心腦血管、腫瘤及免疫系統(tǒng)等疾病[3-4]。

離子液體(Ionic Liquid，IL)是在室溫或近室溫時(shí)由體積較大、結(jié)構(gòu)不對(duì)稱的有機(jī)陽離子和體積較小的無機(jī)/有機(jī)陰離子組成的液態(tài)物質(zhì)[5]。與傳統(tǒng)溶劑相比，IL具有熱穩(wěn)定性好、不揮發(fā)、便于重復(fù)利用等特點(diǎn)[6-8]。由于IL對(duì)目標(biāo)物選擇性高，因此能夠有效提取天然產(chǎn)物中的微量活性成分，目前IL已成為萃取分離領(lǐng)域的一種新型綠色溶劑。微波輔助萃取(Microwave Assisted Extraction，MAE)，是憑借微波對(duì)萃取體系中不同組分具有選擇性加熱的能力，使被萃取物從體系中分離的方法。該法試劑用量少、節(jié)能省時(shí)、產(chǎn)量大[9]，已被廣泛應(yīng)用于天然藥物、食品的萃取和分析。

以IL作為溶劑或共溶劑參與微波輔助萃取，能更好發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)。IL對(duì)微波吸收效果好，熱轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)[10-11]，因此加熱速率快，可極大縮短萃取時(shí)間，且兩者結(jié)合更有利于目標(biāo)物從體系分離，因此，IL微波輔助萃取是一種高效、綠色、安全的提取方法。本實(shí)驗(yàn)以丹皮酚得率為指標(biāo)，利用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)IL微波輔助萃取牡丹皮過程中影響丹皮酚得率的主要因素液固比、pH值、提取溫度、提取功率、提取時(shí)間和IL濃度進(jìn)行優(yōu)化，旨在篩選出提取牡丹皮中丹皮酚的最優(yōu)條件。

1 材料與儀器

1.1 材料、試劑

牡丹皮，2019年采收于安徽銅陵，自然晾干后粉碎過60目，干燥保存。丹皮酚對(duì)照品購置于中國藥品生物制品鑒定所；1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽([Bmin]Br)(純度≥98%)，阿拉丁公司；甲醇、乙腈均為色譜純；其余試劑均為分析純；蒸餾水(18.2 MW)。

1.2 儀 器

Agilent 1100型反相高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Eppendorf AG 22331 Hamburg離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Hi-Tech水純化系統(tǒng)(18.2 MW)，上海和泰儀器有限公司；XH-100A電腦微波催化/合成萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；HE-2078分析型電子天平，北京賽多利斯公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HPLC條件

采用Waters XTerra MS C18柱(4 mm，2.1×250 mm)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水(0.05%甲酸)=95:5(V/V)，等度洗脫，流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長：274 nm，柱溫25 ℃，分析時(shí)間30 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取牡丹皮對(duì)照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并稀釋定容至刻度，制成濃度為1.0 mg/mL牡丹皮對(duì)照品儲(chǔ)備液。加乙醇制備成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使之成為濃度為0.8、1.6、8.0、16.0、80.0、400.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按上述“2.1”項(xiàng)所述色譜條件進(jìn)樣。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并進(jìn)行線性擬合。

2.3 牡丹皮中丹皮酚提取流程及含量測(cè)定

分別取牡丹皮樣品粉末0.5 g，置于250 mL錐形瓶中，加入一定體積的IL水溶液，調(diào)節(jié)pH值，設(shè)定不同溫度、不同功率，提取一定時(shí)間。取適量提取液在25 ℃、轉(zhuǎn)速3000 r/min條件下離心10 min，取20 μL上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

得率計(jì)算公式：

(1)

式中：Y是得率，mg/g；C是丹皮酚濃度，mg/mL；V是提取液體積，mL；M是原料重量，g。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

離子液體([Bmin]Br)水溶液微波輔助萃取牡丹皮中丹皮酚的主要影響因素有液固比、pH值、提取溫度、提取功率、提取時(shí)間和IL濃度。

2.4.1 液固比

稱取牡丹皮樣品粉末0.5 g，按照液固比8:1、10:1、12:1、15:1、20:1、25:1、30:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，調(diào)節(jié)pH值為6，設(shè)定溫度70 ℃，微波功率600 W，提取時(shí)間10 min，提取液離心后，經(jīng)HPLC檢測(cè)并計(jì)算得率。

2.4.2 pH值

稱取牡丹皮樣品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，調(diào)節(jié)pH值分別為4、5、6、7、8、9、10，設(shè)定溫度70 ℃，微波功率600 W，提取時(shí)間10 min，提取液離心后，經(jīng)HPLC檢測(cè)并計(jì)算得率。

2.4.3 提取溫度

稱取牡丹皮樣品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，調(diào)節(jié)pH值為6，設(shè)定溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，微波功率600 W，提取時(shí)間10 min，提取液離心后，經(jīng)HPLC檢測(cè)并計(jì)算得率。

2.4.4 提取功率

稱取牡丹皮樣品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，調(diào)節(jié)pH值為6，設(shè)定溫度70 ℃，微波功率分別為200、300、400、500、600、700、800 W，提取時(shí)間10 min，提取液離心后，經(jīng)HPLC檢測(cè)并計(jì)算得率。

2.4.5 提取時(shí)間

稱取牡丹皮樣品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，調(diào)節(jié)pH值為6，設(shè)定溫度70 ℃，微波功率600 W，提取時(shí)間8、10、12、15、20、25、30 min，提取液離心后，經(jīng)HPLC檢測(cè)計(jì)算得率。

2.4.6 IL濃度

稱取牡丹皮樣品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、1.5 mol/L的IL水溶液，調(diào)節(jié)pH值為6，設(shè)定溫度70 ℃，微波功率600 W，提取時(shí)間10 min，提取液離心后，經(jīng)HPLC檢測(cè)并計(jì)算得率。

2.5 方法驗(yàn)證

稱取牡丹皮樣品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，調(diào)節(jié)pH值為6，設(shè)定溫度70 ℃，微波功率600 W，提取時(shí)間10 min，提取液離心后，經(jīng)HPLC檢測(cè)并計(jì)算得率。以此來驗(yàn)證在牡丹皮在上述條件下提取的穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確證

按照“2.2”項(xiàng)下操作，得到回歸方程為：A=35146X-2975.8(R2=0.9999，n=6)，結(jié)果表明丹皮酚在0.8～400.0 mg/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

3.2 單因素對(duì)牡丹皮中丹皮酚得率的影響

3.2.1 液固比對(duì)得率的影響

設(shè)定溫度70 ℃，微波功率600 W，提取時(shí)間10 min，調(diào)節(jié)pH值為6，以0.5 mol/L的IL水溶液按照不同液固比對(duì)丹皮酚的提取得率詳見表1。可以看出隨著液固比的增加，丹皮酚的得率逐漸增加，當(dāng)液固比達(dá)到15:1，丹皮酚的得率達(dá)到最高，以后得率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，主要原因可能是達(dá)到一定程度液固比后，樣品已被提取的非常充分，再增大將不能獲得更高的得率，綜合考慮選擇(15:1)作為實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)液固比。

表1 不同液固比對(duì)丹皮酚得率的影響

3.2.2 pH值對(duì)得率的影響

按照液固比達(dá)到15:1，設(shè)定溫度70 ℃，微波功率600 W，提取時(shí)間10 min，以0.5 mol/L的IL水溶液，按照不同的pH值，對(duì)丹皮酚的提取得率詳見表2。可以看出在弱堿性(pH=9)丹皮酚的得率最高。可能是因?yàn)榈てし语@弱酸性，在堿性條件下能有較大的溶解度，但堿性過強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致丹皮酚發(fā)生縮合等反應(yīng)，綜合考慮選擇pH=9作為最優(yōu)pH值。

表2 不同pH值對(duì)丹皮酚得率的影響

3.2.3 提取溫度對(duì)得率的影響

按照液固比15:1，微波功率600 W，提取時(shí)間10 min，調(diào)節(jié)pH值為6，以0.5 mol/L的IL水溶液按照不同的提取溫度，對(duì)丹皮酚的提取得率詳見表3。隨著溫度的升高，得率逐漸上升，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，得率達(dá)到0.0717%，80～90 ℃得率下降不大，可能是由于70 ℃時(shí)候IL與藥液接觸最充分，藥液分子分子間作用力最大，活化能最大，提取效率高。綜合考慮選擇70 ℃為最佳提取溫度。

表3 不同提取溫度對(duì)丹皮酚得率的影響

3.2.4 提取功率對(duì)得率的影響

按照液固比15:1，設(shè)定溫度70 ℃，提取時(shí)間10 min，調(diào)節(jié)pH值為6，以0.5 mol/L的IL水溶液按照不同的提取功率，對(duì)丹皮酚的提取得率詳見表4。通過表4可以看出：提取功率在(200～500)W之間，丹皮酚的得率沒有顯著變化，但提取功率增大到600 W時(shí)，丹皮酚得率最大，(700～800)W丹皮酚得率降低。可能是由于功率達(dá)到(700～800)W，使得丹皮酚發(fā)生降解反應(yīng)。綜合考慮選擇600 W為最佳提取功率。

表4 不同提取功率對(duì)丹皮酚得率的影響

3.2.5 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

按照液固比15:1，設(shè)定溫度70 ℃，微波功率600 W，調(diào)節(jié)pH值為6，以0.5 mol/L的IL水溶液按照不同的提取時(shí)間，對(duì)丹皮酚的提取得率詳見表5。通過表5可以看出：在一定范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，丹皮酚得率在增加，當(dāng)提取時(shí)間超過10 min時(shí)，丹皮酚得率降低。綜合考慮選擇10 min為最佳提取時(shí)間。

表5 不同提取時(shí)間對(duì)丹皮酚得率的影響

3.2.6 IL濃度對(duì)得率的影響

按照液固比15:1，設(shè)定溫度70 ℃，微波功率600 W，調(diào)節(jié)pH值為6，提取時(shí)間10 min，以不同濃度的IL水溶液，對(duì)丹皮酚的提取得率詳見表6。可以看出：當(dāng)IL濃度為0.5 mol/L時(shí)，丹皮酚得率最大。可能是由于當(dāng)IL濃度=0.5 mol/L時(shí)，IL與丹皮酚有效接觸面積最大，反應(yīng)最充分。綜合考慮選擇IL濃度=0.5 mol/L為最佳提取IL濃度。

表6 不同IL濃度對(duì)丹皮酚得率的影響

3.3 方法驗(yàn)證

3.3.1 穩(wěn)定性的研究

在上述單因素得到的最優(yōu)條件下，采用IL結(jié)合微波輔助提取牡丹皮中丹皮酚后，丹皮酚的回收率為99.2%，放置7天后，丹皮酚的回收率為97.5%，結(jié)果說明丹皮酚在IL結(jié)合微波輔助萃取方法中穩(wěn)定性較好。

3.3.2 回收率的研究

在上述單因素得到的最優(yōu)條件下，采用IL結(jié)合微波輔助提取牡丹皮中丹皮酚后，丹皮酚的回收率為98.3%，放置7天后，丹皮酚的回收率為97.1%，結(jié)果說明丹皮酚在IL結(jié)合微波輔助萃取方法中回收率較高。

3.3.3 重復(fù)性的研究

稱取5份0.5 g牡丹皮，在上述單因素得到的最優(yōu)條件下，采用IL結(jié)合微波輔助提取牡丹皮中丹皮酚后，丹皮酚的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%，結(jié)果說明牡丹皮中丹皮酚在IL結(jié)合微波輔助萃取方法中重新性較好。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用IL結(jié)合微波輔助提取牡丹皮中的丹皮酚，通過對(duì)影響提取過程中的幾個(gè)關(guān)鍵因素(如：液固比、pH值、提取時(shí)間、提取溫度、提取功率、IL濃度等)進(jìn)行單因素考察，最終篩選出最優(yōu)提取條件。最佳提取條件為：液固比15:1、pH=9、提取溫度70 ℃、提取功率600 W、提取時(shí)間10 min、IL濃度0.5 mol/L，丹皮酚的得率為0.48 mg/g，高于傳統(tǒng)使用乙醇作溶劑的得率。因此，IL結(jié)合微波輔助提取牡丹皮中的丹皮酚是一種高效、可靠、有前途的提取方法。