基于orthogonal design優選墓頭回中總多糖含量測定條件*

王嘉琛，張莉丹，王伊楠，郭宇航，董征艷，姚隆丹，段秀俊

(1 山西藥科職業學院，山西 太原 030031;2 山西中醫藥大學， 山西 太原 030031)

墓頭回始載于李時珍的《本草綱目》，是敗醬科敗醬屬植物糙葉敗醬PatriniascabraBunge和異葉敗醬PatriniaheterophyllaBunge的根莖或全草，性涼，味苦、微酸澀，具有燥濕止帶、收斂止血、清熱解毒的功效[1]。現代研究發現墓頭回中含有豐富的多糖類活性成分，并具有提高機體免疫力、抗菌、抗病毒、抗癌等[2-6]多種作用。近年來對墓頭回中有效成分分離與提純等方面都取得了較大進展，但是對墓頭回中總多糖含量的測定較為少見，因此本實驗對墓頭回中多糖的顯色條件進行優化，并對不同產地墓頭回中總多糖的含量進行測定。

1 材料與儀器

UV-610S紫外-可見分光光度計，上海元析儀器責任有限公司；KQ5200V超聲清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；7D5A-WS離心機，湖南湘立科學儀器有限公司；UW120D十萬分之一電子天平，島津；HH-2數顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司。

墓頭回藥材10批，均購自安徽亳州，為敗醬科敗醬屬植物糙葉敗醬，產品信息情況見表4由山西中醫藥大學段秀俊副教授鑒定為正品；濃硫酸；苯酚(批號：20150506)，購于天津市風船化學試劑科技有限公司；D-葡萄糖標準品(批號：110833-201205)，購于中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇(批號：20190408)，購于天津市北辰方正試劑廠。

2 方法與結果[7-8]

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取經五氧化二磷干燥至恒重的D-無水葡萄糖對照品10.25 mg，加水溶解并定容至50 mL，做為對照品母液(濃度0.205 mg/mL)。精密吸取對照品母液2.5 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，制成濃度為0.0513 mg/mL的葡萄糖對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

取墓頭回粉末(過五號篩)約0.1 g，精密稱定，置50 mL圓底瓶中，加水5 mL，100 ℃回流60 min，放至室溫，加水補足減失的質量，濾過，加無水乙醇至乙醇體積分數為65%，搖勻，置4 ℃冰箱靜置12 h，離心(轉速設定3500 r/min，10 min，下同)，取沉淀加65%乙醇5 mL洗滌1次，離心，取沉淀物加水使溶解，定容到100 mL容量瓶中，即得。

2.2 檢測波長的選擇

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各2.0 mL，各加入具塞試管中加入7%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冷水浴冷卻5 min，置沸水浴中加熱15 min，再置于冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對照，分別用全波長掃描二者的紫外吸收圖譜，顯示二者在489 nm處均有最大吸光度，故選489 nm為最大吸收波長。

2.3 墓頭回中總多糖含量測定顯色條件的優化[9]

2.3.1 單因素實驗考察

2.3.1.1 苯酚濃度對墓頭回中總多糖含量測定結果的影響

精密吸取“2.1.2”項下溶液2.0 mL供試品溶液5份，于具塞試管分別中加入濃度為5%、6%、7%、8%、9%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冰水浴冷卻5 min后，置沸水浴中加熱15 min，再置于冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對照，于489 nm測定吸光度，以苯酚濃度為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪圖，結果見圖1。

圖1 苯酚濃度對于吸光度的影響

2.3.1.2 顯色反應溫度對墓頭回中總多糖含量測定結果的影響

精密吸取“2.1.2”項下溶液2.0 mL供試品溶液5份，于塞試管中加入7%苯酚溶液1 mL搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冰水浴冷卻5 min后，分別置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴中加熱15 min，再置于冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對照，于489 nm測定吸光度，以顯色溫度為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪圖，結果見圖2。

圖2 顯色溫度對于吸光度的影響

2.3.1.3 顯色時間對墓頭回中總多糖含量測定結果的影響

精密吸取“2.1.2”項下溶液2.0 mL供試品溶液5份，于具塞試管中加入7%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冷水浴冷卻5 min，置沸水浴中分別加熱5、10、15、20、25 min，再置冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對照，于489 nm測定吸光度以顯色時間為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪圖，結果見圖3。

圖3 顯色時間對于吸光度的影響

2.3.1.4 靜置時間對墓頭回中總多糖含量測定結果的影響

精密吸取“2.1.2”項下溶液2.0 mL供試品溶液5份，于具塞試管中加入7%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冷水浴中分別冷卻0.5、5.5、10.5、15.5、20.5 min，置沸水浴中加熱15 min，再置于冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對照，于489 nm測定吸光度以靜置時間為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪圖，結果見圖4。

圖4 靜置時間對于吸光度的影響

2.3.1.5 單因素實驗結果分析

通過對苯酚濃度、顯色時間、顯色溫度、靜置時間四個單因素對墓頭回中多糖顯色結果的考察，發現苯酚濃度、顯色時間、顯色溫度對顯色結果影響較大，而靜置時間對結果影響并不明顯，故選擇苯酚濃度、顯色時間、顯色溫度這個三個因素，進行正交實驗考察。

2.3.2 正交實驗法優選顯色條件

以墓頭回中總多糖的含量測定結果為考察指標，選擇對顯色條件影響較大的三個顯色時間、顯色溫度、苯酚濃度做為考察因素，每因素設定三個水平，采用L9(34)表進行正交實驗，因素與水平安排見表1，分別按表2中的九組條件進行正交實驗，并對實驗結果進行了方差分析，結果見表3。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗表及結果

表3 正交實驗方差分析表

由表2可見，最高分的組合為正交4實驗，由此得出的最佳工藝組合為A2B1D3。由表3的正交實驗方差分析表可知，影響吸光度順序為：A(顯色時間)>B(顯色溫度)>D(苯酚濃度)，且A對總多糖的顯色條件有顯著性影響(P<0.05)，B、C沒有顯著性影響(P>0.05)，得出的最佳組合為A2B1D3。因此綜合分析，最佳的實驗條件，即苯酚濃度為9%，水浴溫度為70 ℃，加熱時間為10 min。

2.4 方法學考察[8]

2.4.1 墓頭回總多糖的測定法

根據單因素實驗及正交實驗結果，精密吸取供試品溶液或對照品溶液2.0 mL，于具塞試管中加入9%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置于70 ℃水浴中加熱10 min，再置于冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對照，于489 nm測定吸光度。

2.4.2 線性關系的考察

精密吸取“2.1.1”項下對照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置具塞試管中，蒸餾水補充體積至2.0 mL，加入9%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，置70 ℃水浴中，加熱顯色10分鐘后立即取出，置冰水浴冷卻5 min；精密吸取蒸餾水2 mL同上述操作，作為空白對照，于489 nm測定吸光度。以濃度(x)為橫坐標，以吸光度(y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程y=13.76x+0.0349，R2=0.9997。結果表明，無水葡萄糖溶液在0.00257-0.0513 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.4.3 精密度考察

精密吸取“2.1.1”項下D-葡萄糖對照品溶液，按“2.4.1”項下方法連續測定6次吸光度，得RSD為1.13%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性考察

取1份供試品溶液，按“2.4.1”項下方法每隔10 min，測定吸光度并計算RSD值，RSD為2.1%，表明供試品溶液在1 h內穩定性良好。

2.4.5 重復性考察

取6份供試品溶液，按“2.4.1”項下方法分別測定吸光度值，計算RSD值為2.49%，表明本法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率考察

精密稱取已知總多糖含量的墓頭回多糖粗粉6份，每份約為0.05 g，按樣品中含量加入適量D-葡萄糖對照品，依法測定含量，計算回收率，結果見表4，得加樣回收率均值為99.75%，RSD為2.02%，RSD<3%，表明本法準確性好。

表4 加樣回收率考察結果

2.4.7 不同產地批次的墓頭回含量測定

精密稱取不同產地批次的墓頭回藥材粉末10份，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.4.1”項下方法顯色并重復測定總多糖含量。結果見表5。

表5 不同產地批次的墓頭回含量測定結果

3 討 論

現代研究表明，墓頭回具有抑菌、抗癌、抗氧化、增強機體免疫的功效[9-11]。無論是對于小鼠移植性肝癌腫瘤的抑制[12]亦或對于體外肺源腺癌細胞SPCA-1、人肝癌細胞系HepG2、和人慢性髓系白血病細胞K562的殺滅[13]，均有良好的作用。但研究多集中于多糖的作用，對于不同產地的墓頭回中多糖的含量及最優的顯色條件并無文獻報道，故本文對此進行研究。

本文選取了苯酚濃度、顯色時間、顯色溫度、靜置時間四個單一因素對墓頭回多糖的顯色結果進行考察，發現苯酚濃度、顯色時間、顯色溫度對顯色結果影響較大。隨后進行L9(34)正交實驗，優選了最佳實驗條件。并進行了嚴密的方法學考察，證明此方法嚴謹可行，為墓頭回多糖的測定提供了一種有效可行的方法。

4 結 論

本實驗對不同產地與批次的墓頭回中多糖進行測定，發現不同產地的墓頭回中多糖含量有較大差異，但并未對其余成分進行測定。后續考慮采用HPLC指紋圖譜對墓頭回中其余黃酮及各類成分進行全面定性與定量分析，以期對墓頭回的進一步研究與開發提供一定的參考依據。