美洲大蠊多肽PAP-2對肝癌血管生成、侵襲及轉移能力的影響

張鴻翰，張 蕊，王 瑤，呂 鴻，吳定宇，彭 芳*

（1.大理大學藥學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000；3.昆明市兒童醫院，昆明 650000；4.西雙版納傣族自治州農墾醫院，云南景洪 666100；5.大理大學實驗室管理處，云南大理 671000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上第五大最常見的惡性腫瘤，在全球癌癥死亡率中排名第二〔1-2〕，具有高惡性、高復發率和易轉移的特點。近年來，許多研究集中于腫瘤血管生成〔3-5〕，腫瘤血管生成是與腫瘤微環境有關的重要生物學過程之一〔6〕。HCC是一種典型的血管豐富且惡性程度極高的腫瘤，血管生成在HCC 生長中所起的作用最為突出〔7〕。現階段研究表明HCC 的發生與發展是一個多步驟參與、多因素形成的過程，HCC 的侵襲和轉移與肝癌血管生成存在極為密切的關系〔8-11〕。

在腫瘤治療中，多肽具有一定的優勢，多肽類藥物適應癥比小分子化合物廣泛，療效更為顯著，分子認知性更為優良，代謝毒性相對較低。另外，多肽類藥物的穩定性和純度高于蛋白質藥物，合成成本也相對較低，幾乎不存在免疫原性〔12〕。同時針對性強，研發目標清晰，開發率高等也是多肽類藥物表現出的明顯優勢〔13〕。

美洲大蠊入藥始載于《神農本草》〔14〕中。本研究團隊自1970 年以來就對美洲大蠊進行了系列研究，先后研發了系列源自美洲大蠊的藥物，如用于燒傷、燙傷的康復新液，治療急、慢性心力衰竭的心脈隆注射液和治療乙型肝炎的肝龍膠囊〔15-18〕。

本研究團隊的前期研究已明確美洲大蠊多肽的前體物CⅡ-3和脫脂膏的抗HCC作用〔12，19〕，但它們提取率低、成本高，并且口服給藥時實驗動物依從性低。為了克服這些不足，本課題組從CⅡ-3中分離并鑒定出13 種肽分子，命名為PAP 系列多肽（PAP1～PAP13）。課題組前期對PAP-1、PAP-2和PAP-3作為實驗藥物進行了研究〔12，19-22〕，發現美洲大蠊多肽對HCC微環境的調節可能與下調氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的水平有關。在血管生成方面，美洲大蠊多肽可抑制HepG2細胞和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的增殖與遷移，減少兩種細胞之間的黏附和HUVEC 的小管形成，下調VEGF 的表達，其中，多肽PAP-2效果更好〔12，19-22〕。因此，為深化前期的研究，本實驗以美洲大蠊多肽PAP-2為實驗藥物，采用H22肝癌細胞在Balb∕c 小鼠腋下建立荷瘤移植模型，分析PAP-2 對堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）、金屬基質蛋白酶-9（MMP-9）和CD34的影響，比較PAP-2在體內與CⅡ-3和脫脂膏抗HCC的優劣性，為美洲大蠊多肽的進一步應用提供更有力的支撐和基礎。

1 材料

1.1 藥物、細胞及實驗動物美洲大蠊多肽PAP-2（PF-20160513-02，純度98.057%）、美洲大蠊提取物CⅡ-3、美洲大蠊脫脂膏均由大理大學昆蟲生物醫藥研究院巫秀美博士和張成桂博士提供。

肝癌H22腹水細胞株，由大理大學藥學院藥理學教研室劉曉波副教授饋贈。

SPF 級Balb∕c 小鼠，體質量18～22 g，雌雄各半，購于昆明楚商科技有限公司，動物合格證號：43004700028293，實驗動物飼養于大理大學實驗動物中心IVC屏障系統內。

1.2 試劑與儀器RPMI-1640培養基、胎牛血清培養基（美國Gibco 公司）；青霉素和鏈霉素混合物、0.25%胰蛋白酶-EDTA、二甲基亞砜（北京索萊寶公司）；5-氟尿嘧啶（5-FU，國藥控股化學試劑有限公司）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time qPCR）試劑盒（美國GeneCopoeia＆Inc 公司）；引物由廣州iGene 生物技術有限公司設計；免疫組織化學染色（IHC）的一抗、二抗及試劑盒（美國ABclonal Biotechnology公司）；酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（南京建城生物工程有限公司）。

二級生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；CO2培養箱（美國NUAIRE 公司）；MOTIC 倒置顯微鏡（新加坡SPEED FAIR 公司）；臺式低速離心機（北京時代北利離心機有限公司）；超級純水機（格力電器中山制造有限公司）；自動脫水機、連續切片機（美國Leica 公司）；生物組織包埋機（中國孝感市宏業醫用儀器有限公司）。

2 方法

2.1 美洲大蠊各提取物的制備美洲大蠊脫脂膏的制備：將美洲大蠊全蟲干燥后進行粉碎，用70%乙醇冷浸提取3次，將所得乙醇液進行合并、濃縮、提取獲得浸膏，浸膏到脫脂膏的平均收得率為75.18%。美洲大蠊提取物CⅡ-3 的制備：將美洲大蠊脫脂膏上聚酰胺柱，依次應用水及不同比例的含水甲醇洗脫，定量收集，分別濃縮，冷凍干燥后即為所用樣品，提取物占生藥的比率為0.2%。美洲大蠊多肽PAP-2用注射用水配置成濃度為1 g∕L 的母液于4 ℃保存，實驗時用培養基將藥物稀釋到所需濃度即可。

2.2 H22荷瘤模型小鼠的建立移植原代H22肝癌細胞于小鼠腹腔并傳代7 d，無菌抽取第2代小鼠腹水，以0.9%氯化鈉溶液稀釋，0.4%臺盼藍計數，當細胞活力＞95%后，取細胞密度為1×107個∕mL 的細胞懸液0.4 mL，于小鼠右腋窩處接種，當小鼠腋窩處出現明顯瘤組織時即造模成功。

2.3 分組與給藥將造模成功的100 只小鼠隨即分為10 組，每組10 只（雌雄各半），分別為模型組（0.9%氯化鈉溶液）、5-FU 組（陽性對照藥物，20 mg∕kg）、PAP-2 低劑量組（50 mg∕kg）、PAP-2 中劑量組（100 mg∕kg）、PAP-2 高劑量組（200 mg∕kg）、PAP-2 和5-FU 聯用低劑量組（50 mg∕kg PAP-2 和20 mg∕kg 5-FU）、PAP-2 和5-FU 聯用中劑量組（100 mg∕kg PAP-2 和20 mg∕kg 5-FU）、PAP-2 和5-FU 聯用高劑量組（200 mg∕kg PAP-2 和20 mg∕kg 5-FU）、CⅡ-3 組（200 mg∕kg CⅡ-3）、脫脂膏組（200 mg∕kg脫脂膏）。每只小鼠稱重后給藥，給藥容量為0.1 mL∕10 g。分組當天定義為D0 天，并于D0 天開始給藥，其中，陽性藥5-FU 隔天腹腔注射1 次；0.9%氯化鈉溶液、PAP-2、CⅡ-3 和脫脂膏灌胃給藥，每天給藥1 次，均連續給藥10 d。在D10 天對所有小鼠安樂死處理，取材。

2.4 瘤質量及臟器指數的測定小鼠末次給藥24 h后，眼內眥取血，然后脫頸處死，剝取瘤塊及臟器（脾、胸腺和肝），按下列公式計算抑瘤率及臟器指數：抑瘤率（%）=（模型組小鼠平均瘤質量－實驗組小鼠平均瘤質量）∕模型組小鼠平均瘤質量×100%；臟器指數=臟器（脾、胸腺和肝）質量（mg）∕體質量（g）。

2.5 蘇木精-伊紅（HE）染色10%中性福爾馬林液固定肝組織，進行脫水、包埋、切片（厚度4 μm），進行HE 染色，染色后于倒置顯微鏡下觀察標本病理學改變。

2.6 ELISA 法檢測bFGF、TGF-β、MMP-9 和CD34的含量小鼠眼內眥取血后，將全血于4 ℃環境下放置2 h，然后在4 ℃條件下以4 000 r∕min離心15 min，吸取上清，置于-20 ℃保存，備用。采用ELISA 法測定各組小鼠血清中bFGF、TGF-β、MMP-9 和CD34的含量。

2.7 Real-time qPCR 法檢測bFGF、TGF-β、MMP-9的mRNA 表達依照All-in-OneTMFirst-cDNA Synthesis Kit 試劑盒和All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒說明書上的步驟進行Real-time qPCR 反應，各引物序列見表1，將反應液加入PCR 管中，設置的擴增程序為95 ℃、10 min，1個循環；95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40個循環；95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s。分析反應板數據，從而獲得每個樣品反應的Ct值，與模型組比較后，取2-ΔΔCt值進行數據統計。

2.8 IHC 法檢測bFGF、TGF-β、MMP-9 和CD34 的表達將“2.5”中包埋好的組織切片，置于70 ℃恒溫箱中烤片0.5 h。檢測時二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫二甲苯，檸檬酸抗原修復，3%過氧化氫阻斷、滅活內源性過氧化物酶，5%脫脂奶粉封閉，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗脫后滴加bFGF（1：400）、TGF-β（1：400）、MMP-9（1：50）和CD34（1：300）的一抗，4 ℃孵育過夜，次日室溫復溫30 min，棄一抗，PBS沖洗3 次，每次5 min。再加二抗（1：200），室溫孵育30 min，棄二抗，PBS 沖洗3 次，每次3 min。DAB 反應染色10 min，蘇木素復染，干燥，封片。用Image-Pro Plus 6.0測量陽性表達的吸光度（A）值。

2.9 統計學分析采用SPSS 16.0 統計分析軟件進行分析，數據以（±s）表示。組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 Real-time qPCR引物序列表

3 結果

3.1 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠瘤塊質量的影響與模型組相比，其余各給藥組均在不同程度上對H22荷瘤小鼠腫瘤有抑制作用，且PAP-2 各劑量組與PAP-2 和5-FU 聯用各劑量組對腫瘤的抑制作用呈現一定的劑量依賴性。PAP-2 中、高劑量組與PAP-2 和5-FU 聯用中、高劑量組對腫瘤抑制作用均優于CⅡ-3組和脫脂膏組（P＜0.05）。見表2。

表2 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠瘤塊質量的影響（xˉ± s,n = 10）

3.2 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠臟器指數的影響與模型組相比，5-FU 組脾臟指數和肝臟指數均顯著降低，說明5-FU對小鼠的臟器有一定損傷作用。與5-FU 組相比，其余各給藥組胸腺指數（PAP-2和5-FU聯用高劑量組及CⅡ-3組除外）、脾臟指數和肝臟指數都高于5-FU 組（P＜0.05），提示PAP-2對免疫器官有一定保護作用。見表3。

表3 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠臟器指數的影響（xˉ± s,n = 10）

3.3 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠腫瘤組織形態學的影響經HE 染色后鏡下觀察，可見瘤組織呈現巢狀或片狀生長，腫瘤細胞排列緊密，細胞大小不一、形態各異，異形明顯，核大深染，易見核分裂相、并見病理性核分裂。模型組染色較深，壞死面積較小。與模型組相比，其余各組染色相對較淺，呈現不同程度的壞死，腫瘤組織壞死面積相對較大。提示經美洲大蠊多肽PAP-2 及美洲大蠊提取物CⅡ-3 和脫脂膏處理后，腫瘤組織的惡性程度減輕，腫瘤組織的侵襲能力減弱。見圖1。

圖1 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠腫瘤組織形態學的影響（倒置顯微鏡，×100）

3.4 ELISA 檢測美洲大蠊多肽PAP-2 對H22荷瘤小鼠血清 中bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β 的影 響與模型組相比，其余各組小鼠血清中bFGF 含量明顯減少，說明PAP-2 能夠降低血清中bFGF 含量；CⅡ-3 組和脫脂膏組在一定程度上下調了血清中CD34 的含量；PAP-2 中劑量組降低了血清中MMP-9的含量；5-FU組、PAP-2高劑量組、CⅡ-3組和脫脂膏組在一定程度上下調了小鼠血清中TGF-β的含量（P＜0.05）。與5-FU組相比，PAP-2中、高劑量組下調血清中CD34作用不如5-FU組（P＜0.05），其余各組差異無統計學意義，血清中bFGF、CD34、MMP-9和TGF-β含量相差不大。見表4。

3.5 IHC 分析美洲大蠊多肽PAP-2 對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β 蛋白的影響

3.5.1 美洲大蠊多肽PAP-2 對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF 蛋白的影響 IHC 結果見圖2，棕色的細胞為陽性，即bFGF 蛋白表達，顏色的深淺與蛋白表達量多少成正比。從圖2 可觀察到，模型組染色較深，bFGF 蛋白表達較多，與模型組相比，其余各給藥組棕色有不同程度變淺，說明bFGF 蛋白表達有不同程度的下降。

表4 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠血清中bFGF、CD34、MMP-9和TGF-β的影響（xˉ±s,n=10,ng∕mL）

圖2 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF蛋白表達的影響（倒置顯微鏡，×400）

經分析數據結果顯示，與模型組相比，陽性藥5-FU 處理后，腫瘤組織中bFGF 平均光密度值降低顯著，說明5-FU能下調腫瘤組織中bFGF表達，其余各給藥組（除PAP-2低劑量組、CⅡ-3組和脫脂膏組外）中bFGF 表達均呈現不同程度的下降，且5-FU組作用優于PAP-2 各劑量組、CⅡ-3 組和脫脂膏組，PAP-2 中、高劑量組下調腫瘤組織中bFGF 蛋白表達的作用優于CⅡ-3 組和脫脂膏組，PAP-2和5-FU 聯用低劑量組對腫瘤組織中bFGF 蛋白的下調作用優于PAP-2低劑量組（P＜0.05）。見表5。

表5 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中相關蛋白表達的影響（平均光密度，xˉ± s，n = 10）

3.5.2 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中CD34蛋白的影響 IHC結果見圖3，棕色的細胞為陽性，即CD34蛋白表達，顏色的深淺代表蛋白表達量的多少。從圖3可觀察到，模型組染色較深，CD34蛋白表達較多，與模型組相比，其余各給藥組棕色有不同程度變淺，說明CD34蛋白表達有不同程度的下降。

由表5 可知，與模型組相比，陽性藥5-FU 作用后，腫瘤組織中CD34 光密度值降低明顯，說明5-FU 能明顯下調腫瘤組織中CD34 表達，其余各給藥組中CD34 表達均呈現不同程度的下降，且5-FU組對腫瘤組織中CD34 的下調作用優于PAP-2 各劑量組、CⅡ-3 組和脫脂膏組，PAP-2 中、高劑量組降低腫瘤組織中CD34 蛋白作用優于CⅡ-3 組和脫脂膏組（P＜0.05）。

3.5.3 美洲大蠊多肽PAP-2 對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中MMP-9 蛋白的影響 IHC 結果見圖4，染為棕色的細胞為陽性，即MMP-9 蛋白表達，顏色的深淺代表蛋白表達量的多少。從圖4 可以觀察到，模型組染色細胞較多、染色較深，表明MMP-9 蛋白表達較多，與模型組相比，其余各給藥組棕色有不同程度變淺，說明MMP-9 蛋白表達有不同程度的下降。

圖4 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中MMP-9蛋白的影響（倒置顯微鏡，×400）

從表5 可知，與模型組相比，陽性藥5-FU 處理后，腫瘤組織中MMP-9 光密度值降低明顯，說明5-FU 能下調腫瘤組織中MMP-9 蛋白表達，其余各給藥組中MMP-9 表達均呈現不同程度的下降，提示美洲大蠊多肽PAP-2 和美洲大蠊提取物CII-3 和脫脂膏能夠下調腫瘤組織中MMP-9 蛋白的表達，且5-FU 作用優于CII-3 和脫脂膏，PAP-2 作用優于CⅡ-3和脫脂膏（P＜0.05）。

3.5.4 美洲大蠊多肽PAP-2 對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中TGF-β蛋白的影響 IHC 結果見圖5，棕色的細胞表示陽性，即代表TGF-β蛋白的表達，顏色的深淺代表蛋白表達量的多少。從圖5 可以觀察到，模型組棕色細胞較多、棕色較深，說明TGF-β蛋白表達相對較多，與模型組相比，其余各給藥組棕色有不同程度變淺，顯示TGF-β蛋白表達有不同程度的下降。

從表5 可知，與模型組相比，陽性藥5-FU 處理后，腫瘤組織中TGF-β光密度值降低顯著，說明5-FU 能明顯下調腫瘤組織中TGF-β蛋白表達，其余各給藥組中TGF-β表達均呈現不同程度的下降，PAP-2 下調腫瘤組織中TGF-β蛋白表達作用優于CⅡ-3和脫脂膏，PAP-2和5-FU聯用中劑量組下調腫瘤組織中TGF-β蛋白表達作用優于PAP-2 中劑量組（P＜0.05）。

圖5 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中TGF-β蛋白的影響（倒置顯微鏡，×400）

3.6 Real-time qPCR 測定美洲大蠊多肽PAP-2 對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF mRNA、MMP-9 mRNA和TGF-β mRNA 的影響與模型組相比，5-FU 組，PAP-2 中、高劑量組，PAP-2 和5-FU 聯用中、高劑量組均對荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF mRNA 呈現上調趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05），其中5-FU組上調作用最明顯，而CⅡ-3 組荷瘤小鼠腫瘤組織的bFGF mRNA 的表達有所下調（P＜0.05）。與模型組比較，5-FU 組，PAP-2低、中劑量組，PAP-2和5-FU聯用低、中劑量組，CII-3 組和脫脂膏組都能從不同程度上調荷瘤小鼠腫瘤組織中MMP-9 mRNA 的表達，差異有統計學意義（P＜0.05），PAP-2 對MMP-9 mRNA 表達的上調作用與PAP-2 的劑量呈負相關。與模型組相比，PAP-2低、中劑量組，PAP-2和5-FU聯用高劑量組都能上調荷瘤小鼠腫瘤組織中TGFβmRNA 的表達，差異有統計學意義（P＜0.05），其中PAP-2 低劑量組的上調作用相對較優，而PAP-2高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織中TGF-βmRNA 的表達有所下調（P＜0.05）。見表6。

表6 美洲大蠊多肽PAP-2對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF mRNA、MMP-9 mRNA和TGF-β mRNA的影響（xˉ± s，n = 10）

4 討論

HCC 微環境是由細胞成分、肝癌細胞、其余多類除肝細胞外互相作用的細胞和非細胞成分細胞外基質組成的復雜的肝癌產生、發展和遷移的內環境〔23〕。在正常的生理條件下，肝癌微環境由于組織和器官的自我穩定性而處于動態平衡。然而，在癌癥的早期，各種腫瘤促進因子在打破肝癌微環境的原始平衡中起作用，導致微環境向肝癌的有利方向發展。

本研究發現PAP-2 對腫瘤有抑制作用，而且抗腫瘤作用是劑量依賴性的，劑量越高，抗腫瘤效果越好，且效果優于CⅡ-3 和脫脂膏（P＜0.05）。PAP-2 對器官損傷有一定的保護作用。 ELISA 結果表明，PAP-2 只能下調H22荷瘤小鼠血清中bFGF的含量。荷瘤小鼠血清中bFGF、CD34 和TGF-β的含量在PAP-2、CⅡ-3 和脫脂膏的作用下差異無統計學意義。IHC 結果表明，PAP-2 可以降低H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β 蛋白的表達。此外，PAP-2 在抑制小鼠腫瘤組織中CD34、MMP-9 和TGF-β 蛋白的表達方面較優。ELISA 和IHC 共同表明，PAP-2 在抑制腫瘤組織中的bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β的表達以及肝癌的血管生成和侵襲轉移方面的作用優于CⅡ-3 和脫脂膏。

Real-time qPCR 結果顯示，PAP-2 可以上調H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF、MMP-9 和TGF-β的mRNA 表達。qPCR 實驗的某些結果與IHC 的結果相反。該結果的可能性如下：動物體內，藥物的代謝是一個極其復雜的過程，再加上諸如肝癌等可變的腫瘤環境，其中的過程和最終結果是不可預測的。 PAP-2 是從CⅡ-3 中提取的一種多肽單體，尚不清楚其對肝癌的特異性作用位點和作用機理。實驗測量的這些指標在肝癌的血管生成、侵襲和轉移過程中會相互影響，并且某些指標同時處于肝癌的早期和晚期。有相反的效果，具體原因仍不清楚。

總之，從該實驗中可以看出，PAP-2 可以抑制荷瘤小鼠H22的腫瘤生長，這可能與bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β蛋白表達下調有關。這些因子與肝癌的血管生成、侵襲和轉移密切相關，因此PAP-2 的作用機制可能是抑制肝癌的血管生成、侵襲和轉移。

綜上所述，美洲大蠊多肽PAP-2 對肝癌的血管生成、侵襲和轉移的影響優于CⅡ-3和脫脂膏，表明PAP-2具有繼續研究的意義和價值。對于PAP-2上調腫瘤組織中bFGF、MMP-9 和TGF-βmRNA 表達的結果，可為下一步該組動物實驗提供參考和啟示，具體原因有待進一步研究和探索。同時，這也表明影響肝癌血管生成的因素并不十分局限，無法在本研究中提及，正在等待更多的研究人員發現和探索。