分心木提取物對大鼠HIRI的保護作用初探

王永寬，田新雁，蘇 娟，龐 博，周 萍*

（1.大理大學藥學院，云南大理 671000；2.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000）

肝缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝臟缺血一段時間后再恢復血流灌注，再灌注不但沒有使肝臟結構、功能恢復，反而使損傷程度加重的現象〔1〕。HIRI 是肝移植、休克復蘇、嚴重肝外傷及肝葉切除等過程中不可避免的，嚴重時可導致肝功能衰竭，甚至死亡，是肝移植術后肝功能衰竭的主要原因〔2〕。目前，已有大量關于HIRI發生機制的研究，其中認為自由基氧化應激損傷是其重要的機制之一〔3〕，需要有效的方法來預防或減輕這種肝損傷。

分心木（Diaphragma juglandisFructus）是胡桃科胡桃屬核桃（Juglans regiaL.）果核內的木質隔膜，含有大量的生物活性物質，如酚酸類、黃酮類、萜類、多糖類等，具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗炎、抗微生物、抗誘變、免疫調節和保護心血管等功能，被廣泛用于治療腹瀉、腎虛、失眠遺精、血尿、保肝和子宮出血等〔4-7〕。分心木提取物的體外研究已發現其乙酸乙酯部位酚酸類成分具有較好的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基及超氧陰離子清除能力，并能有效抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性，體內研究發現其在大鼠125 mg∕（kg·d）的灌胃劑量下，具有較好的抗氧化活性，且無明顯毒副作用〔8-9〕。

分心木作為核桃加工過程中的副產物，資源豐富，但目前主要用作燃料或直接丟棄，浪費資源。本研究用分心木乙酸乙酯部位提取物預處理大鼠HIRI 模型，以觀察其對HIRI 的保護作用及機制，為深入研究開發利用分心木的藥用價值提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料分心木乙酸乙酯部位提取物實驗室自制；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測試盒、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、一氧化氮（NO）測試盒、XOD 測試盒和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒均購自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白質定量試劑盒購自天根生化科技有限公司；同型半胱氨酸（Hcy）測定試劑盒購自上海泛柯實業有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器JR-30鼠恒溫實驗臺（成都泰盟軟件有限公司）；TGL-18R冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；Haier 超低溫保存箱（海爾股份有限公司）；VCX130超聲細胞粉碎儀（美國SONICS&MATERIALS公司）；HH-2 數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；GL-88B 旋渦混合器（海門其林貝爾儀器有限公司）；T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；BioTek Synergy HT多功能酶標儀（基因有限公司）；OLYMPUS BX53 熒光顯微鏡（上海土森視覺科技有限公司）。

2 方法

2.1 實驗動物分組與給藥30 只同一批次的SPF級SD 雄性大鼠，體質量為（200±20）g，購自于昆明醫科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（滇）2015-0002，隨機編號分為空白組（S組）、缺血-再灌注組（I∕R 組）和給藥組（DJ 組）3 組，每組10 只。適應性飼養7 d 后，DJ 組灌胃分心木乙酸乙酯部位提取物125 mg∕（kg·d）〔9〕，S組和I∕R 組灌胃給予同等劑量的0.9%氯化鈉溶液，連續給藥14 d后造模。

2.2 HIRI模型建立造模前12 h內禁食不禁水。用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠（0.6 mL∕100 g），并將其固定于鼠臺上，控制體溫（37±0.5）℃，下腹正中切口，暴露出肝門三靜脈。根據劉俊平等〔10〕的方法，I∕R 組和DJ 組采用無創血管夾夾閉左外側葉和中葉的肝動脈、門靜脈，阻斷入肝約70% 血流90 min，S 組僅行肝蒂騷擾，90 min 后縫合腹部切口兩層。繼續飼養24 h后取材，于-80 ℃凍存備用。

2.3 肝組織病理學變化取一部分左外肝葉組織，4%多聚甲醛固定，蘇木精-伊紅（HE）染色法制備4 μm厚切片，鏡下觀察肝組織病理損傷變化。

2.4 肝功能指標測定按照試劑盒說明書步驟，取肝組織勻漿上清液，先采用BCA 法測定蛋白濃度，再用紫外可見分光光度計測組織勻漿中AST和ALT的OD值并計算活力。

2.5 肝組織生化指標檢測根據試劑盒說明書依次測定肝組織中MDA、SOD、XOD、NO、GSH-Px 和Hcy的OD值并計算相應酶活力及含量。

2.6 數據統計分析應用SPSS 20.0 統計軟件對數據進行分析處理，計量資料以（xˉ±s）來表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行組間比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠HIRI 建模情況通過HIRI 建模，可見肝顏色由鮮紅變為暗紅，再恢復供血24 h，其間顏色恢復即初步判定造模成功。見圖1。

圖1 大鼠肝臟缺血前、后情況

3.2 肝組織病理變化HE染色結果顯示，S組肝臟肝細胞形態正常，排列整齊，中央靜脈清晰完整。見圖2A。I∕R 組肝竇受擠壓消失，肝索結構紊亂，肝細胞水腫，變性，且出現大量炎性細胞浸潤。見圖2B。DJ組肝組織病理形態較I∕R組均有不同程度的改善，肝細胞水腫、變性、壞死和炎性細胞浸潤減輕，說明大鼠在分心木的預處理下，能減輕HIRI。見圖2C。

圖2 大鼠肝組織病理變化（HE染色，×200）

3.3 大鼠肝功能的變化AST 和ALT 活力是反映肝組織損傷程度的重要標志。與S組相比，I∕R 組大鼠肝組織中AST 和ALT 酶活力均明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。而與I∕R 組相比，DJ組大鼠肝組織中AST 和ALT 酶活力均明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 大鼠肝組織中AST和ALT的活力變化（xˉ± s，U∕gprot）

3.4 大鼠肝臟氧化指標的變化與S 組相比，I∕R組大鼠肝組織中XOD 的活力明顯升高，SOD 和GSH-Px 的活力明顯降低，MDA 和NO 含量升高，差異均有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。而與I∕R組相比，DJ 組大鼠肝組織中XOD 的活力明顯降低，SOD 和GSH-Px 的活力均升高，MDA 和NO 含量降低，差異均有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

3.5 大鼠肝臟中Hcy 含量的變化與S 組相比，I∕R組大鼠肝組織中Hcy 含量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。而與I∕R 組相比，DJ 組大鼠肝組織中Hcy含量明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 大鼠肝組織中XOD、SOD、GSH-Px活力及MDA、NO、Hcy含量的變化（xˉ± s）

4 討論

HIRI是一個多因素參與的復雜病理生理過程，其中氧化應激作為參與HIRI的一個重要途徑，主要通過活性氧（ROS）的大量產生參與HIRI 發生的過程，在HIRI 中起到關鍵作用。當發生HIRI 時活化的Kupffer 細胞和肝細胞以及內皮竇細胞氧化呼吸鏈減少，產生大量ROS 如超氧陰離子和過氧化氫（H2O2）等〔11-12〕。當機體無法清除體內多余ROS 時，生物膜發生脂質過氧化反應，使細胞結構改變并導致其功能代謝障礙等，其代謝產物如MDA等可破壞膜的完整性，使膜脆性增加，細胞內外物質交換發生障礙，影響膜的正常功能，導致細胞及組織廣泛性損傷〔13〕。

細胞內XOD 是HIRI 時形成ROS 的重要來源。肝臟缺血時，胞內ATP 代謝為次黃嘌呤在缺血肝組織中大量堆積，隨著供氧中斷，引起ATP 耗竭，Na+-K+-ATP泵功能失調，Na+聚集胞內激活Na+∕Ca2+逆向轉運蛋白，導致Ca2+進入胞內增多，促使大量的黃嘌呤脫氫酶快速轉化為XOD。當血流再灌注時，大量的O2分子隨血流進入缺血組織與XOD 催化，使次黃嘌呤代謝為黃嘌呤的氧化反應加速，進而使再灌注組織內ROS 迅速增加，超出機體的清除能力從而加重組織損傷〔14〕。

Hcy是一種具有細胞毒性的含硫氨基酸，是心腦血管疾病的獨立危險因子，與多種疾病的發生發展相關〔15〕。當肝臟功能不全或受損時，會導致機體糖類、脂質類及氨基酸等代謝障礙，其中Hcy代謝也將會受阻〔16〕。隨著Hcy 水平的不斷升高，心腦血管疾病的危險度也隨之增加。Hcy的巰基在重金屬離子（如Fe3+或Cu2+）的催化下易發生氧化應激反應，生成超氧化物、H2O2及羥自由基等活性氧損傷細胞。Hcy巰基的自身氧化，會促進ROS生成，ROS與NO發生反應，并使其失活；Hcy 還會干擾谷胱甘肽（GSH）合成，抑制GSH與NO相互作用導致血管損傷等〔17〕。

分心木富含多種類型活性成分，這些活性成分按照極性大小分布于不同部位，在功能上主要體現在抗氧化以及抗菌、抗炎方面。研究〔18〕表明，通過對分心木中單體化合物進行體外抗氧化性能分析，發現沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、咖啡酸等酚酸類成分均具有較好的抗氧化活性，并且研究發現總酚酸含量較高的乙酸乙酯部位具有明顯的體內抗氧化效果〔9〕，這為分心木治療由氧化應激引起的疾病提供了理論依據。

HIRI 的藥物預處理是利用藥物中某些生物活性物質直接或間接的藥理作用來增強細胞或組織對該損傷的耐受性，從而使損傷程度減輕的一種有效防治方法。本研究通過用分心木乙酸乙酯提取物預處理HIRI 大鼠來檢測其肝功能指標、氧化指標、Hcy水平及觀察組織病理切片，探討分心木提取物對肝缺血再灌注損傷的抗氧化作用。結果顯示，與I∕R 組比較，DJ 組大鼠在用分心木提取物預處理后，AST 和ALT 的活力明顯降低，肝組織病理結構損傷均有不同程度改善。說明肝臟缺血-再灌注前給予分心木提取物預處理能改善肝臟的功能，減輕肝細胞的損傷，具有保護肝臟的作用。DJ組大鼠肝組織SOD 和GSH-Px 活力明顯升高，MDA 和NO 含量降低，XOD 活力和Hcy 含量顯著降低，說明分心木提取物預處理能減輕肝細胞生物膜脂質過氧化反應，減少黃嘌呤氧化途徑產生的自由基，減輕Hcy的自身氧化作用，提高抗氧化能力，減輕HIRI。