Cx26在D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷中的表達

王 斌，賴碩林，宋豫皎，何欣然，王燁婷，趙釤妤

（1.大理大學第一附屬醫院，云南大理 671000；2.大理大學臨床醫學院，云南大理 671000；3.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000）

縫隙連接（gap junction，GJ）也叫間隙連接或通訊連接，是細胞間直接通訊的方式之一。GJ是一種特殊的膜結構，由相鄰兩個細胞間的連接通道排列而成，其基本單位是連接子，每個連接子由6個縫隙連接蛋白（connexin，Cx）環繞排列成中空的半通道而成，即跨膜蛋白通道〔1〕。GJ 有細胞連接的機械作用，亦能促進鄰近細胞間電信號及化學信號的傳遞，對細胞的新陳代謝、增殖分化、機體內外環境的穩定等生理過程起著重要的調控作用〔2〕。GJ 細胞間信號交流對于肝臟的生物學性能具有重要作用，可參與血漿蛋白的合成等〔3〕。目前所發現的Cx 有20 多種，根據分子量的大小對其命名。在肝臟中主要表達有Cx26、Cx32、Cx37、Cx40、Cx43〔4-5〕，有研究表明，在急性肝損傷中，連接蛋白有不同的表達及變化格局〔6〕，而研究主要集中于脂多糖、四氯化碳等誘導的急性肝損傷中Cx26、Cx32 及Cx43 的表達。D-半乳糖胺亦可引起急性肝損傷，但機理與其他因素不同，D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷，并不直接損傷肝細胞，但可干擾肝細胞磷酸尿嘧啶核苷。D-半乳糖胺進入體內后與磷酸尿苷結合，形成磷酸尿苷-半乳糖胺復合物，致磷酸尿苷耗竭，使依賴其生物合成的核酸、糖蛋白、脂糖等的合成受到抑制，限制細胞器及酶的生成和補充，細胞器、生物膜受損、鈣離子內流，從而造成肝細胞損傷〔7〕。在D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷中，Cx26 的表達如何，尚未見報道。因此，本研究建立D-半乳糖胺誘導的大鼠急性肝損傷模型，觀察其肝功能情況、肝組織病理改變、Cx26 的蛋白及mRNA 表達情況，旨在闡明Cx26在D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷中的作用。聯苯雙酯是治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷的常用藥物，本研究采用聯苯雙酯作為陽性對照藥，以期闡明其治療肝損傷的機制與Cx26的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性SD 大鼠15 只，體質量150～180 g，由昆明艾尼莫實驗動物養殖中心提供，合格證號：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 主要藥物、試劑及儀器D-半乳糖胺鹽酸鹽（MACKLIN 公司，批號：D810561）；聯苯雙酯（MACKLIN公司，批號：D843898）；Cx26（Bioss公司，批號：bs-1715R）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，Servicebio公司，批號：GB12002）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Servicebio 公司，批號：G2003）；動物組織總RNA 提取試劑盒（離心柱型）（天根生化科技（北京）有限公司，批號：DP431）；FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒（去基因組）（天根生化科技（北京）有限公司，批號：KR116）；SuperReal 熒光定量預混試劑（增強版）（SYBR Green）（天根生化科技（北京）有限公司，批號：FP205）；β-actin 內參基因（生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號：B661202）。DT5-3型低速臺式自動平衡離心機（北京時代北利離心機有限公司）；生化分析儀（型號：7180，日立公司）；Real-Time PCR 儀（Applied Biosystems 公司）；顯微鏡（型號：E100，NiKon公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型建立 將15 只大鼠隨機分為3 組，其中正常對照組（Con 組）、D-半乳糖胺組（D 組）、D-半乳糖胺-聯苯雙酯組（D-聯組）各5 只。 所有動物按照實驗室大鼠飼養標準進行飼養，室溫保持在（25±1）℃。飼養2 d適應環境后，給藥。Con組：腹腔注射0.5 mL 無菌0.9%氯化鈉溶液；D 組：用0.9%氯化鈉溶液將D-半乳糖胺鹽酸鹽配成10%溶液，再用1 mol∕L NaOH溶液調節pH至7.0，按400 mg∕kg 體質量一次性給予腹腔注射〔7〕；D-聯組：在注射D-半乳糖胺前1 h 腹腔注射聯苯雙酯20 mg∕kg〔7〕。給藥24 h后麻醉老鼠，取其靜脈血，處死老鼠，取其肝臟。

1.3.2 標本處理方式 取出肝臟組織后迅速稱重，并計算肝體比指數（肝體比指數=肝濕重∕體質量×100%）。選取2塊肝組織，其一放于4%多聚甲醛中固定48 h，用于石蠟切片，蘇木精-伊紅（Hematoxylineosin，HE）染色；其二放于樣本保護液中，便于提取RNA 或蛋白，用于實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time qPCR）實驗或蛋白質印跡法（Western Blot，WB）。

1.3.3 血清指標檢測 每只大鼠取血后，3 000 r∕min離心5 min，取上清液，采用速率法測定血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）的含量。

1.3.4 病理改變觀察 肝臟組織進行固定、脫水、透明、浸蠟與包埋、切片、脫蠟、染色、封固等處理后，在顯微鏡下觀察肝臟病變情況。

1.3.5 WB 檢測Cx26 蛋白的含量 肝臟組織加入裂解液研磨提取總蛋白，加入蛋白緩沖液沸水煮15 min 進行蛋白變性，蛋白進行SDS-PAGE 電泳、轉膜、免疫反應（一抗1：500，5%脫脂奶粉；二抗1：3 000），化學發光。采用Alpha 軟件處理系統分析目標條帶的光密度值（Cx26含量=Cx26條帶灰度值∕GAPDH內參條帶灰度值）。

1.3.6 Real-time qPCR 法 檢 測Cx26 的mRNA 含 量各組組織按動物組織總RNA 提取試劑盒操作步驟進行RNA 的提取，測濃度，按FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒將RNA 逆轉為cDNA，嚴格按照SuperReal 熒光定量預混試劑進行RT-PCR 檢測。其中引物由生工生物合成，Cx26基因序列在NCBI上查找（正向引物：CTACACCACCAGCATCTTCTTCCG，反向引物：CCAGGCGTTACACTTCACCAGAC）。以β-actin 為內參基因。采用2-△△Ct法對目的基因進行定量分析。

1.4 數據處理所有數據經SPSS 17.0 軟件進行處理，數據以（xˉ±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝體比指數與D組相比，D-聯組肝體比指數稍增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。其余差異無統計學意義。見表1。

表1 大鼠肝體比指數（xˉ± s，n=5）

2.2 大鼠血清中AST、ALT 含量與Con 組相比，D組及D-聯組血清中AST、ALT 含量均明顯增高（P＜0.05）；AST∕ALT值均明顯降低（P＜0.05）。而D組與D-聯組差異無統計學意義。見表2。

表2 大鼠血清中AST、ALT含量測定結果（xˉ± s，n=5）

2.3 各組間病理改變情況Con 組肝小葉結構正常，肝細胞正常；D 組可見肝小葉結構破壞，明顯的肝細胞壞死及炎癥細胞浸潤，肝血竇變窄；D-聯組情況同D組相似，但炎癥細胞浸潤更為明顯。見圖1。

2.4 Cx26 蛋白含量與Con 組（0.405 8 ± 0.162 5）相比，D 組（0.635 4±0.114 9）Cx26 蛋白含量明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；D-聯組（0.473 1±0.219 7）稍有增加，差異無統計學意義。與D 組相比，D-聯組Cx26 含量下降，但差異無統計學意義。見圖2。

圖2 Cx26蛋白的表達

2.5 Cx26 的mRNA 含量 與Con 組相比，D 組及D-聯組中Cx26 的mRNA 含量均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與D 組相比，D-聯組Cx26 的mRNA含量降低，但差異無統計學意義。見表3。

表3 Cx26的mRNA含量（xˉ± s，n=5）

3 討論

肝臟是體內重要的臟器，也是各種疾病常侵襲的器官，代謝、中毒、微生物、循環障礙及腫瘤等均可造成肝臟的損傷。本研究結果表明，在D-半乳糖胺引起的肝損傷中，血清中AST、ALT 顯著升高，提示模型復制成功。ALT 分布于細胞漿，對肝臟疾病最為敏感；AST分布于肝細胞漿和線粒體中，本實驗結果顯示AST∕ALT 值比Con 組降低，提示由D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷，損傷了肝細胞的細胞膜，但是對細胞器的損傷可能還不嚴重。

GJ 通道允許電、化學信號及代謝產物通過，GJ信號交流受細胞因子、生長因子、一氧化氮等的調控，使其對于細胞損傷比較敏感〔6〕。肝臟中主要表達5 種連接蛋白，其中肝細胞主要表達Cx26、Cx32，非實質肝細胞主要表達Cx37、Cx40 和Cx43〔4-5〕。研究表明，Cx26、Cx32 及Cx43 與藥物、脂多糖及缺血再灌注損傷相關的肝急性損傷及炎癥密切相關〔6〕。以往對Cx 在急性肝損傷中的研究主要集中于脂多糖、四氯化碳，對乙酰氨基酚等造成的急性肝損傷則主要針對Cx32 和Cx43〔6〕，對Cx26 的研究較少。在體外培養的肝細胞中，抑制Cx26 和Cx32 可減少由對乙酰氨基酚引起的細胞死亡〔9〕；封閉Cx26 和Cx43，阻礙Cx43的過表達可能是減少急性毒性引起的肝損傷的潛在治療靶點〔6〕。脂多糖引起的SD 大鼠肝損傷中，Cx26 和Cx32 減少，Cx43 增加，這跟炎癥反應密切相關〔10-11〕。有研究〔12〕認為，這些Cxs 在基因水平上表達的下調是通過轉錄后機制形成的。本研究結果表明，D-半乳糖胺可引起SD 大鼠肝細胞壞死及炎癥細胞浸潤，Cx26 的蛋白含量明顯增加，而mRNA 含量卻明顯降低。Cx26 蛋白表達增加可能跟炎癥反應相關，或許是適應D-半乳糖胺的刺激，為致細胞損傷的因子進行細胞間的交流提供方便。由此可推測，抑制Cx26 的表達，也許是治療由于D-半乳糖胺引起的急性肝損傷的潛在靶點。Cx26 的蛋白及mRNA 含量不一致，可能是mRNA 半衰期短或者是存在轉錄后調控的問題，有待進一步研究。

本研究中采用聯苯雙酯作為陽性對照藥，結果顯示聯用聯苯雙酯組大鼠血清AST 及ALT 并未降低，肝細胞壞死依然明顯，這可能源于給藥時間短及次數少。但聯苯雙酯在一定程度上逆轉了Cx26的表達，可推測聯苯雙酯治療肝損傷的機制可能跟細胞間直接的信號交流有關。

通過對Cx26 在D-半乳糖胺引起的大鼠急性肝損傷中的表達進行研究，發現其表達升高，提示若抑制Cx26 的表達，或許可減少與D-半乳糖胺致病機理類似的藥物性損傷的細胞間的信號交流，為新藥研究提供一定的實驗支持，為藥物治療機制的闡明提供一定的佐證。Cx26 受何調控，為何其在基因、蛋白水平表達不一致等問題，有待進一步研究。