浙江省溫嶺地區(qū)帕金森病患者DJ-1 基因g.168_185del 的多態(tài)性研究

李紅娟，郭潔潔，王琳琳

帕金森病（PD）是一種常發(fā)生于老年人的錐體外系疾病[1]，大部分為散發(fā)，5%～10%為早發(fā)型[2]，隨年齡的增長(zhǎng)，其發(fā)病率和患病率也相應(yīng)增加。近年來(lái)基因成為PD 致病原因的研究熱點(diǎn)，且研究表明不同基因所致PD 患者的表現(xiàn)具有異質(zhì)性[3]。DJ-1 基因即PARK7，有剪切位點(diǎn)突變、截短突變和大片段缺失等10 余種不同的突變[4]。本研究探討浙江省溫嶺地區(qū)DJ-1 基因位點(diǎn)g.168_185del的多態(tài)性與PD 發(fā)病的關(guān)系，報(bào)道如下

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016 年11 月至2018 年12 月就診于浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及康復(fù)科的原發(fā)性PD 患者109 例（PD 組），其中男60 例，女49 例；年齡31 ～85 歲，平均（64.4±11.8）歲。另選同期來(lái)本院體檢中心無(wú)PD的健康者105 例（對(duì)照組），其中男56例，女49 例；年齡33 ～87 歲，平均（65.6±12.4）歲。兩組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。

1.2 診斷及排除標(biāo)準(zhǔn) 以英國(guó)Brain-Bank 診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩查[5]，有條件者可做顱腦CT 或MRI 檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、繼發(fā)性PD、帕金森疊加綜合征及甲狀腺功能亢進(jìn)等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取 抽取受試者靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，使用北京天根中量血提取試劑盒提取DNA。檢測(cè)DNA 純度均在1.7 ～1.9，濃度均≥15 ng/ l。抽血前應(yīng)根據(jù)知情自愿的原則簽署同意書(shū)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 運(yùn)用primer3設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為277 bp。擴(kuò)增的上下游引物詳見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)條件為：在Biometr熱循環(huán)儀上95℃先預(yù)變性5min，再95 ℃變性40 s，再58 ℃退火30 s，后72 ℃變性30 s，再72 ℃10 min，使其得到充分的延伸。PCR 總反應(yīng)體積為20 l。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因型鑒定 鑒定所擴(kuò)增259 ～277 bp 部分，該片段如出現(xiàn)TGTGCTGGACGGTGTCCC 18 個(gè)堿基序列，判定為g.168_185del 多態(tài)位點(diǎn)的插入/插入型，見(jiàn)封三彩圖2；該片段18個(gè)堿基中1 至多個(gè)被其他堿基替換，判定為插入/缺失型，見(jiàn)封三彩圖3；如在259 bp18 個(gè)堿基完全消失，判定為缺失/缺失型，本研究未見(jiàn)到此種基因型。等位基因頻率的計(jì)算公式為2n1+n2/2N（n1 為純合型等位基因數(shù)，n2 為雜合型等位基因數(shù)，N 為總個(gè)體數(shù)）。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)；采用遺傳平衡檢驗(yàn)基因型資料。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 平衡定律吻合度檢驗(yàn) 病例組與對(duì)照組進(jìn)行缺失/插入型、插入/插入型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），兩組基因型分布吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg 平衡定律。

2.2 g.168_185del等位基因頻率分布比較 兩組多態(tài)性位點(diǎn)g.168_185del等位基因頻率、基因型頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），見(jiàn)表1。PD 組與對(duì)照組g.168_185del多態(tài)性在≤50 歲和＞50 歲間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2；g.168_185del多態(tài)性在男性和女性間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

據(jù)最新流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)65 歲以上人群中PD 發(fā)病率與西方發(fā)達(dá)國(guó)家相似，約為1.7%[2]，且發(fā)病率隨著年齡的增加而增加，但目前對(duì)于PD 的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確。

DJ-1 定位于1p36，全長(zhǎng)約24 kb，為常染色體隱性遺傳致病基因。Eerola 等[7]研究表明病例組和對(duì)照組在等位基因頻率及基因型頻率上均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。郭紀(jì)鋒等[8]研究發(fā)現(xiàn)在我國(guó)PD 患者中DJ-1 基因突變的突變率非常罕見(jiàn)。柳四新等[9]對(duì)早發(fā)組與晚發(fā)組的研究未發(fā)現(xiàn)DJ-1 基因差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究顯示PD組與對(duì)照組間DJ-1 基因g.168_185del的基因型頻率及等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮 g.168_185del多態(tài)性與浙江沿海溫嶺地區(qū)PD 無(wú)明顯相關(guān)性。缺失型等位基因頻率在PD組為6.4%，PD組等位基因缺失型在早發(fā)性大于在對(duì)照組的頻率，分別為5.8%和4.2%。本研究顯示PD 組與對(duì)照組g.168_185del 多態(tài)性在年齡、性別間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明其多態(tài)性與年齡、性別關(guān)系不大。

表1 兩組g.168_185del 等位基因頻率和基因型頻率分布 例（%）

表2 兩組不同年齡間g.168_185del 多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較 例（%）

表3 兩組不同性別間g.168_185del 多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較 例（%）

除Hedrick 等[10]報(bào)道的DJ-1 基因l～5 號(hào)外顯子的純合缺失突變，以及5～7 號(hào)的雜合缺失突變外，DJ-1 基因外顯子的重排突變很少有報(bào)道。Hedrick等通過(guò)對(duì)100 例早發(fā)型PD患者的研究，發(fā)現(xiàn)只有2 例有DJ-1 的改變，而17 例患者有Parkin 的突變。蔡苗等[11]研究表明EOPD 組與對(duì)照組、家族性及散發(fā)性EOPD組與對(duì)照組間，g.168_185del多態(tài)的基因型頻率和等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究示缺失/插入型突變較缺失/缺失型較多相比，前者相對(duì)稍多，后者罕見(jiàn)，而DJ-1 基因g.168_185del在早發(fā)PD 中的確切致病作用還有待進(jìn)一步闡明。由于樣本量以及抽樣誤差等原因，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究驗(yàn)證。