浙江省溫嶺地區帕金森病患者DJ-1 基因g.168_185del 的多態性研究

李紅娟，郭潔潔，王琳琳

帕金森病（PD）是一種常發生于老年人的錐體外系疾病[1]，大部分為散發，5%～10%為早發型[2]，隨年齡的增長，其發病率和患病率也相應增加。近年來基因成為PD 致病原因的研究熱點，且研究表明不同基因所致PD 患者的表現具有異質性[3]。DJ-1 基因即PARK7，有剪切位點突變、截短突變和大片段缺失等10 余種不同的突變[4]。本研究探討浙江省溫嶺地區DJ-1 基因位點g.168_185del的多態性與PD 發病的關系，報道如下

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016 年11 月至2018 年12 月就診于浙江省溫嶺市第一人民醫院神經內科及康復科的原發性PD 患者109 例（PD 組），其中男60 例，女49 例；年齡31 ～85 歲，平均（64.4±11.8）歲。另選同期來本院體檢中心無PD的健康者105 例（對照組），其中男56例，女49 例；年齡33 ～87 歲，平均（65.6±12.4）歲。兩組性別、年齡差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。

1.2 診斷及排除標準 以英國Brain-Bank 診斷標準進行篩查[5]，有條件者可做顱腦CT 或MRI 檢查。排除標準：其他神經系統疾病、繼發性PD、帕金森疊加綜合征及甲狀腺功能亢進等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取 抽取受試者靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，使用北京天根中量血提取試劑盒提取DNA。檢測DNA 純度均在1.7 ～1.9，濃度均≥15 ng/ l。抽血前應根據知情自愿的原則簽署同意書。

1.3.2 引物設計與合成 運用primer3設計聚合酶鏈反應（PCR）擴增引物，擴增片段長度為277 bp。擴增的上下游引物詳見文獻[6]。

1.3.3 PCR 擴增 PCR 反應條件為：在Biometr熱循環儀上95℃先預變性5min，再95 ℃變性40 s，再58 ℃退火30 s，后72 ℃變性30 s，再72 ℃10 min，使其得到充分的延伸。PCR 總反應體積為20 l。

1.3.4 PCR擴增產物基因型鑒定 鑒定所擴增259 ～277 bp 部分，該片段如出現TGTGCTGGACGGTGTCCC 18 個堿基序列，判定為g.168_185del 多態位點的插入/插入型，見封三彩圖2；該片段18個堿基中1 至多個被其他堿基替換，判定為插入/缺失型，見封三彩圖3；如在259 bp18 個堿基完全消失，判定為缺失/缺失型，本研究未見到此種基因型。等位基因頻率的計算公式為2n1+n2/2N（n1 為純合型等位基因數，n2 為雜合型等位基因數，N 為總個體數）。

1.4 統計方法 使用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，計數資料比較采用2檢驗；采用遺傳平衡檢驗基因型資料。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 平衡定律吻合度檢驗 病例組與對照組進行缺失/插入型、插入/插入型頻率差異無統計學意義（均P ＞0.05），兩組基因型分布吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg 平衡定律。

2.2 g.168_185del等位基因頻率分布比較 兩組多態性位點g.168_185del等位基因頻率、基因型頻率分布差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表1。PD 組與對照組g.168_185del多態性在≤50 歲和＞50 歲間差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2；g.168_185del多態性在男性和女性間差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表3。

3 討論

據最新流行病學統計，我國65 歲以上人群中PD 發病率與西方發達國家相似，約為1.7%[2]，且發病率隨著年齡的增加而增加，但目前對于PD 的確切發病機制尚不明確。

DJ-1 定位于1p36，全長約24 kb，為常染色體隱性遺傳致病基因。Eerola 等[7]研究表明病例組和對照組在等位基因頻率及基因型頻率上均差異無統計學意義。郭紀鋒等[8]研究發現在我國PD 患者中DJ-1 基因突變的突變率非常罕見。柳四新等[9]對早發組與晚發組的研究未發現DJ-1 基因差異有統計學意義。本研究顯示PD組與對照組間DJ-1 基因g.168_185del的基因型頻率及等位基因頻率差異均無統計學意義，考慮 g.168_185del多態性與浙江沿海溫嶺地區PD 無明顯相關性。缺失型等位基因頻率在PD組為6.4%，PD組等位基因缺失型在早發性大于在對照組的頻率，分別為5.8%和4.2%。本研究顯示PD 組與對照組g.168_185del 多態性在年齡、性別間差異均無統計學意義。這表明其多態性與年齡、性別關系不大。

表1 兩組g.168_185del 等位基因頻率和基因型頻率分布 例（%）

表2 兩組不同年齡間g.168_185del 多態位點基因型頻率和等位基因頻率比較 例（%）

表3 兩組不同性別間g.168_185del 多態位點基因型頻率和等位基因頻率比較 例（%）

除Hedrick 等[10]報道的DJ-1 基因l～5 號外顯子的純合缺失突變，以及5～7 號的雜合缺失突變外，DJ-1 基因外顯子的重排突變很少有報道。Hedrick等通過對100 例早發型PD患者的研究，發現只有2 例有DJ-1 的改變，而17 例患者有Parkin 的突變。蔡苗等[11]研究表明EOPD 組與對照組、家族性及散發性EOPD組與對照組間，g.168_185del多態的基因型頻率和等位基因頻率差異均無統計學意義。本研究示缺失/插入型突變較缺失/缺失型較多相比，前者相對稍多，后者罕見，而DJ-1 基因g.168_185del在早發PD 中的確切致病作用還有待進一步闡明。由于樣本量以及抽樣誤差等原因，有待擴大樣本量進一步研究驗證。