姜黃素對UUO大鼠腎組織中ASK1、JNK/AP-1信號通路及Periostin蛋白表達的影響

楊麗微 康曉明 楊松

【摘要】目的：研究姜黃素對凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signalregulating kinase 1，ASK1）及c-jun氨基酸末端激酶（c-junN-terminalkinase ，JNK）/轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activatedprotein-1，AP-1）信號通路以及骨膜蛋白（Periostin）在單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠間質(zhì)纖維化腎臟組織中的作用及影響。方法：將正常雄性 Wistar大鼠72只，分為假手術(shù)組，UU0組，姜黃素治療組。各組大鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻模型，治療組（姜黃素2OOmg/ kg.d用0.9%生理鹽水溶解后2毫升灌胃）、假手術(shù)組、UU0組（僅采用等量生理鹽水灌胃）于術(shù)后3d、7d和14d，分別處死三組實驗大鼠。結(jié)果：與相應(yīng)時間點空白組對比，隨UUO大鼠梗阻時間延長，腎小管間質(zhì)損傷和纖維化程度加重，ASK1、JNK1、Periostin蛋白表達逐漸增加差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （ P<0.05），相較模型組治療組大鼠腎間質(zhì)組織中 ASK1、JNK1、Periostin蛋白表達顯著降低差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （ P<0.05）結(jié)論：姜黃素可能通過抑制腎組織中ASK1進而影響JNK/AP-1通路的表達，影響其下游Periostin蛋白的表達量，從而改善腎間質(zhì)纖維化程度。

【關(guān)鍵詞】腎臟纖維化 姜黃素 ASK1 JNK/AP-1通路 Periostin蛋白

【中圖分類號】R97 ? 【文獻標識碼】A ? 【文章編號】2026-5328（2021）12--02

腎小管間質(zhì)纖維化是各種病因?qū)е履I臟實質(zhì)及間質(zhì)細胞損傷后引發(fā)的最終組織學(xué)轉(zhuǎn)歸過程[1]。腎纖維化的主要病理包括炎性細胞浸潤、成纖維細胞活化和增殖，以及主要由膠原、纖連蛋白和蛋白聚糖組成的細胞外基質(zhì)成分的異常增加和過度沉積[2]。此外，越來越多的證據(jù)表明細胞外基質(zhì)的衍生成分可用作危險相關(guān)分子模式作為纖維化的重要促進者，只要炎癥刺激因素持續(xù)存在，這些損傷會在細胞活化和損傷階段產(chǎn)生并持續(xù)釋放信號，最終促進炎癥向纖維化腎臟疾病發(fā)展[3]。近年來逐漸發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗臟器纖維化的潛能，可通過不同途徑發(fā)揮抗肺纖維化、肝纖維化、心纖維化及腎纖維化作用，具體抗纖維化機制尚不明確[4]。姜黃素能夠抗氧化和清除自由基，抑腎間質(zhì)纖維化，可調(diào)節(jié)UUO大鼠腎功能指標水平，改善腎組織的病理變化，進而改善腎間質(zhì)纖維化和腎功能[5]。姜黃素對大鼠的保護作用與其抑制氧化應(yīng)激、增強機體抗氧化能力、提高抗炎因子表達、抑制促炎因子表達有關(guān)，從而起到抑制腎間質(zhì)ECM增生、基底膜增厚、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，延緩腎功能衰竭。

1.材料與方法

1.1實驗動物及試劑

SPF ，雄性，Wistar大鼠，72只，體重約140±10g。

姜黃素，兔抗大鼠ASK1，JNK1，Periostin蛋白多克隆抗體，DAB 顯色試劑盒、免疫組化試劑盒，動物組織總RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，實時熒光定量PCR試劑盒。

1.2方法

1.2.1實驗步驟

將正常雄性 Wistar大鼠72只，體重在15Og±1Og，分為假手術(shù)組， UU0組，姜黃素治療組。各組的大鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻模型，應(yīng)用水合氯醛 0.1g/kg，配置成1：10濃度進行灌胃，待角膜反射消失，于背部行縱切口，逐層剝離左側(cè)輸尿管，遠離腎盂1cm結(jié)扎輸尿管。假手術(shù)組只是通過游離大鼠的輸尿管，不結(jié)扎。治療組（姜黃素2OOmg/ kg.d用0.9%生理鹽水溶解后2毫升灌胃）、假手術(shù)組、UU0組（僅采用等量生理鹽水灌胃） ，手在術(shù)后3d、7d和14d結(jié)束時，分別處死三組實驗大鼠，取左側(cè)腎臟。通過蘇木精 — 伊紅染色法 和實時熒光定量-PCR檢測觀察各組實驗大鼠腎臟中的病理變化及ASK1、JNK1、Periostin蛋白和mRNA的表達變化情況。

1.2.2HE染色

各組腎組織依次脫水、透明、浸蠟及包埋，制成3μm 切片，分別行 HE 染色，觀察腎小管間質(zhì)損傷和纖維化狀況。對損傷程度進行評分（TIS）。

1.2.3PCR步驟

將冷存腎組織進行均勻研磨，移入DNA-Cleaning Column管中，分次離心純化完成總RNA的提取。而后在冰上進行操作將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，將反轉(zhuǎn)錄出的cDNA用于實時熒光定量PCR檢測。根據(jù)標準曲線，熒光定量PCR儀自動分析，計算出結(jié)果。

1.3.統(tǒng)計學(xué)方法

使用SP SSs25..0統(tǒng)計軟件對本實驗研究數(shù)據(jù)進行分析，各組別數(shù)據(jù)皆以均數(shù)±標準差（）的形式表示，組間比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1HE結(jié)果分析

鏡下觀察，假手術(shù)組大鼠不同時間點腎臟整體成分，結(jié)構(gòu)無明顯異常，UUO組大鼠術(shù)后第3天HE染色結(jié)構(gòu)顯示腎小管官腔輕度擴張，上皮細胞出現(xiàn)輕度水腫，出現(xiàn)少量炎癥細胞浸潤。第7天，管腔結(jié)構(gòu)擴張明顯，且數(shù)量增多，可見少許脫落的上皮細胞及蛋白管型，炎癥細胞滲出進一步增多;術(shù)后14天可見腎臟皮髓質(zhì)層明顯萎縮變小，管腔嚴重變形，管腔表皮細胞出現(xiàn)壞死、脫落較重，大量炎細胞浸潤。與UUO組對應(yīng)時間點相比，治療組損傷程度減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖一

2.2pcr

2.3.1三組實驗大鼠ASK1 mRNA的表達

PCR結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腎組織中ASK1 mRNA的表達量較少，相較于假手術(shù)組UUO組大鼠各時間點腎組織中ASK1 mRNA表達量隨梗阻時間延長逐漸增高;與UUO組相對應(yīng)的時間點ASK1 mRNA的表達對比，治療組的表達均下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）。見表一

2.3.2 大鼠腎臟組織JNK1-mRNA表達的檢測

PCR結(jié)果顯示：假手術(shù)組中JNK1-mRNA少量表達，相較于假手術(shù)組UUO組各時間點JNK1-mRNA表達呈現(xiàn)升高趨勢，與UUO組同時間點JNK1-mRNA表達量對比，治療組表達均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（bP<0.05）。見表一

2.3.3大鼠腎臟組織periostin mRNA表達的檢測

PCR結(jié)果顯示：假手術(shù)組中periostin mRNA少量表達，同比假手術(shù)組UUO組各時間點periostin mRNA表達呈上升走勢，與UUO組同時間點periostin mRNA表達量對比，治療組表達均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（bP<0.05）。見表一

3.討 論

ASK1在各種纖維化疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。腎組織活檢發(fā)現(xiàn)在各類纖維化腎臟疾病患者中，ASK1下游信號通路JNK活化水平在腎小球和腎小管間質(zhì)中增加。有研究表明，腎損傷的修復(fù)與JNK引起的促纖維化信號有關(guān)，并且JNK可以抑制單側(cè)輸尿管梗阻的腎小管間質(zhì)纖維化，其作用的發(fā)揮可能與其下游periostin蛋白的抑制有關(guān)， 當代中國中醫(yī)藥經(jīng)典著作《中華本草》《中華人民共和國藥典》中都提到了姜黃素具有止痛、清心、活血、行氣、驅(qū)寒、消炎等藥用價值。近年來逐漸發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗臟器纖維化的潛能，姜黃素能夠抑制腎小管上皮細胞增殖，阻止腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化，并能減少EMC質(zhì)成分的合成，具有干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的作用。結(jié)合本實驗研結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASK1、JNK1、periostin隨梗阻時間延長表達量逐漸增加， 論證periostin是重要的致纖維化因子，并且其致纖維化作用是通過ASK1調(diào)節(jié)JNK/AP-1通路實現(xiàn)的。本實驗通過姜黃素干預(yù)后更進一步證明姜黃素可影響ASK1表達，從而調(diào)節(jié)JNK/AP-1通路，干預(yù)其下游periostin對纖維化過程中間質(zhì)沉積及間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用，從而延緩腎纖維化的進程，發(fā)揮保護腎臟的作用，本實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素是治療腎臟纖維化極具潛力的藥物，但具體的作用機制有待于進一步深入研究。

參考文獻：

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