楊麗微 康曉明 楊松


【摘要】目的:研究姜黃素對凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signalregulating kinase 1,ASK1)及c-jun氨基酸末端激酶(c-junN-terminalkinase ,JNK)/轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activatedprotein-1,AP-1)信號通路以及骨膜蛋白(Periostin)在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠間質(zhì)纖維化腎臟組織中的作用及影響。方法:將正常雄性 Wistar大鼠72只,分為假手術(shù)組,UU0組,姜黃素治療組。各組大鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻模型,治療組(姜黃素2OOmg/ kg.d用0.9%生理鹽水溶解后2毫升灌胃)、假手術(shù)組、UU0組(僅采用等量生理鹽水灌胃)于術(shù)后3d、7d和14d,分別處死三組實驗大鼠。結(jié)果:與相應(yīng)時間點空白組對比,隨UUO大鼠梗阻時間延長,腎小管間質(zhì)損傷和纖維化程度加重,ASK1、JNK1、Periostin蛋白表達逐漸增加差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P<0.05),相較模型組治療組大鼠腎間質(zhì)組織中 ASK1、JNK1、Periostin蛋白表達顯著降低差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P<0.05)結(jié)論:姜黃素可能通過抑制腎組織中ASK1進而影響JNK/AP-1通路的表達,影響其下游Periostin蛋白的表達量,從而改善腎間質(zhì)纖維化程度。
【關(guān)鍵詞】腎臟纖維化 姜黃素 ASK1 JNK/AP-1通路 Periostin蛋白
【中圖分類號】R97 ? 【文獻標識碼】A ? 【文章編號】2026-5328(2021)12--02
腎小管間質(zhì)纖維化是各種病因?qū)е履I臟實質(zhì)及間質(zhì)細胞損傷后引發(fā)的最終組織學(xué)轉(zhuǎn)歸過程[1]。腎纖維化的主要病理包括炎性細胞浸潤、成纖維細胞活化和增殖,以及主要由膠原、纖連蛋白和蛋白聚糖組成的細胞外基質(zhì)成分的異常增加和過度沉積[2]。此外,越來越多的證據(jù)表明細胞外基質(zhì)的衍生成分可用作危險相關(guān)分子模式作為纖維化的重要促進者,只要炎癥刺激因素持續(xù)存在,這些損傷會在細胞活化和損傷階段產(chǎn)生并持續(xù)釋放信號,最終促進炎癥向纖維化腎臟疾病發(fā)展[3]。近年來逐漸發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗臟器纖維化的潛能,可通過不同途徑發(fā)揮抗肺纖維化、肝纖維化、心纖維化及腎纖維化作用,具體抗纖維化機制尚不明確[4]。姜黃素能夠抗氧化和清除自由基,抑腎間質(zhì)纖維化,可調(diào)節(jié)UUO大鼠腎功能指標水平,改善腎組織的病理變化,進而改善腎間質(zhì)纖維化和腎功能[5]。姜黃素對大鼠的保護作用與其抑制氧化應(yīng)激、增強機體抗氧化能力、提高抗炎因子表達、抑制促炎因子表達有關(guān),從而起到抑制腎間質(zhì)ECM增生、基底膜增厚、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化,延緩腎功能衰竭。
1.材料與方法
1.1實驗動物及試劑
SPF ,雄性,Wistar大鼠,72只,體重約140±10g。
姜黃素,兔抗大鼠ASK1,JNK1,Periostin蛋白多克隆抗體,DAB 顯色試劑盒、免疫組化試劑盒,動物組織總RNA提取試劑盒,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,實時熒光定量PCR試劑盒。
1.2方法
1.2.1實驗步驟
將正常雄性 Wistar大鼠72只,體重在15Og±1Og,分為假手術(shù)組, UU0組,姜黃素治療組。各組的大鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻模型,應(yīng)用水合氯醛 0.1g/kg,配置成1:10濃度進行灌胃,待角膜反射消失,于背部行縱切口,逐層剝離左側(cè)輸尿管,遠離腎盂1cm結(jié)扎輸尿管。假手術(shù)組只是通過游離大鼠的輸尿管,不結(jié)扎。治療組(姜黃素2OOmg/ kg.d用0.9%生理鹽水溶解后2毫升灌胃)、假手術(shù)組、UU0組(僅采用等量生理鹽水灌胃) ,手在術(shù)后3d、7d和14d結(jié)束時,分別處死三組實驗大鼠,取左側(cè)腎臟。通過蘇木精 — 伊紅染色法 和實時熒光定量-PCR檢測觀察各組實驗大鼠腎臟中的病理變化及ASK1、JNK1、Periostin蛋白和mRNA的表達變化情況。
1.2.2HE染色
各組腎組織依次脫水、透明、浸蠟及包埋,制成3μm 切片,分別行 HE 染色,觀察腎小管間質(zhì)損傷和纖維化狀況。對損傷程度進行評分(TIS)。
1.2.3PCR步驟
將冷存腎組織進行均勻研磨,移入DNA-Cleaning Column管中,分次離心純化完成總RNA的提取。而后在冰上進行操作將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈,將反轉(zhuǎn)錄出的cDNA用于實時熒光定量PCR檢測。根據(jù)標準曲線,熒光定量PCR儀自動分析,計算出結(jié)果。
1.3.統(tǒng)計學(xué)方法
使用SP SSs25..0統(tǒng)計軟件對本實驗研究數(shù)據(jù)進行分析,各組別數(shù)據(jù)皆以均數(shù)±標準差()的形式表示,組間比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.結(jié)果
2.1HE結(jié)果分析
鏡下觀察,假手術(shù)組大鼠不同時間點腎臟整體成分,結(jié)構(gòu)無明顯異常,UUO組大鼠術(shù)后第3天HE染色結(jié)構(gòu)顯示腎小管官腔輕度擴張,上皮細胞出現(xiàn)輕度水腫,出現(xiàn)少量炎癥細胞浸潤。第7天,管腔結(jié)構(gòu)擴張明顯,且數(shù)量增多,可見少許脫落的上皮細胞及蛋白管型,炎癥細胞滲出進一步增多;術(shù)后14天可見腎臟皮髓質(zhì)層明顯萎縮變小,管腔嚴重變形,管腔表皮細胞出現(xiàn)壞死、脫落較重,大量炎細胞浸潤。與UUO組對應(yīng)時間點相比,治療組損傷程度減輕,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖一
2.2pcr
2.3.1三組實驗大鼠ASK1 mRNA的表達
PCR結(jié)果顯示:假手術(shù)組大鼠腎組織中ASK1 mRNA的表達量較少,相較于假手術(shù)組UUO組大鼠各時間點腎組織中ASK1 mRNA表達量隨梗阻時間延長逐漸增高;與UUO組相對應(yīng)的時間點ASK1 mRNA的表達對比,治療組的表達均下降,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見表一
2.3.2 大鼠腎臟組織JNK1-mRNA表達的檢測
PCR結(jié)果顯示:假手術(shù)組中JNK1-mRNA少量表達,相較于假手術(shù)組UUO組各時間點JNK1-mRNA表達呈現(xiàn)升高趨勢,與UUO組同時間點JNK1-mRNA表達量對比,治療組表達均降低,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(bP<0.05)。見表一
2.3.3大鼠腎臟組織periostin mRNA表達的檢測
PCR結(jié)果顯示:假手術(shù)組中periostin mRNA少量表達,同比假手術(shù)組UUO組各時間點periostin mRNA表達呈上升走勢,與UUO組同時間點periostin mRNA表達量對比,治療組表達均降低,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(bP<0.05)。見表一
3.討 論
ASK1在各種纖維化疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。腎組織活檢發(fā)現(xiàn)在各類纖維化腎臟疾病患者中,ASK1下游信號通路JNK活化水平在腎小球和腎小管間質(zhì)中增加。有研究表明,腎損傷的修復(fù)與JNK引起的促纖維化信號有關(guān),并且JNK可以抑制單側(cè)輸尿管梗阻的腎小管間質(zhì)纖維化,其作用的發(fā)揮可能與其下游periostin蛋白的抑制有關(guān), 當代中國中醫(yī)藥經(jīng)典著作《中華本草》《中華人民共和國藥典》中都提到了姜黃素具有止痛、清心、活血、行氣、驅(qū)寒、消炎等藥用價值。近年來逐漸發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗臟器纖維化的潛能,姜黃素能夠抑制腎小管上皮細胞增殖,阻止腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化,并能減少EMC質(zhì)成分的合成,具有干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的作用。結(jié)合本實驗研結(jié)果發(fā)現(xiàn),ASK1、JNK1、periostin隨梗阻時間延長表達量逐漸增加, 論證periostin是重要的致纖維化因子,并且其致纖維化作用是通過ASK1調(diào)節(jié)JNK/AP-1通路實現(xiàn)的。本實驗通過姜黃素干預(yù)后更進一步證明姜黃素可影響ASK1表達,從而調(diào)節(jié)JNK/AP-1通路,干預(yù)其下游periostin對纖維化過程中間質(zhì)沉積及間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用,從而延緩腎纖維化的進程,發(fā)揮保護腎臟的作用,本實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素是治療腎臟纖維化極具潛力的藥物,但具體的作用機制有待于進一步深入研究。
參考文獻:
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