新生兒缺血缺氧性腦病患兒血清CCL5 GM-CSF表達及其與預后相關性

韋 偉 軒 妍 許文婷 曹 祥

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)臨床常表現為意識障礙、昏迷等，甚至可發生中樞性呼吸衰竭、腦癱，是導致新生兒死亡的重要疾病之一。目前臨床上僅根據患兒神經功能及腦電圖很難評估病情發展及預后情況，影響治療方案的制定。因此仍需繼續探索診療HIE的新靶點，提高其治療與預后水平。趨化因子可介導免疫細胞發生定向趨化，趨化因子5(chemokine 5,CCL5)屬于趨化因子家族，受體存在于大腦中，其表達直接參與機體多種疾病的發展，具有調節細胞生長、分化的功能，并可參與中樞神經系統疾病的病理、生理過程。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)是一種具有刺激骨髓干細胞增殖和抑制粒細胞凋亡作用的造血細胞因子，其可抑制粒細胞凋亡、增殖和分化。神經細胞凋亡被認為是缺血缺氧性腦損傷的重要病理環節之一，GM-CSF在神經系統中的作用有待深入研究。關于CCL5、GM-CSF在HIE患兒血清中的表達及與預后的相關性鮮有報道，因此本研究致力于闡述CCL5、GM-CSF在HIE患兒機體內的表達及其預后相關性，以探討其在HIE中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2015年1月至2019年5月在海南省婦女兒童醫學中心出生的82例HIE患兒作為患病組，根據患兒病情嚴重程度分為輕度組(31例)、中度組(26例)與重度組(25例)，另取同期60例健康新生兒作為健康組。所有接受本次研究的受試者及其家屬均知情同意，并全部簽署知情同意書，本研究符合《赫爾辛基宣言》，獲得本院倫理委員會審核、批準后實施。

1.2 納入與排除標準 患病組納入標準：①HIE患兒父母自愿同意參加本次研究且同意預后隨訪；②新生兒均符合HIE診斷標準；③母親孕期在我院的檔案健全，無其他醫院治療史；④均為足月生產；⑤新生兒未輸過血或其他輸注血液制品。排除標準：①新生兒體質量<2.5 kg；②新生兒有先天性心、肝、腎等重要臟器功能性障礙；③新生兒患有其他慢性神經系統感染或畸形發育等其他疾病；④母親孕期資料不全，有嚴重不良嗜好等其他情況。

1.3 試劑與儀器 酶標儀(型號：UV-0442，北京奧芬蘭生物科技有限公司)，人趨化因子(CCL5/RANTES)酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：HGTM-1002A，上海江萊生物科技有限公司)，人GM-CSF ELISA試劑盒(貨號：69-98253，武漢默沙克生物科技有限公司)，離心機(型號：DFB-1800，德國Eppendorf公司)。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品采集 所有新生兒均在出生后72 h內空腹常規采取肘部靜脈血5 mL，靜置20～30 min，5 000 g/min，4℃離心20 min，取上層血清，分裝到于無菌Eppendof管中，-20℃保存，待檢。

1.4.2 酶聯免疫吸附法檢測CCL5、GM-CSF的表達 將凍存的血清取出靜置30 min左右，采用CCL5/RANTES試劑盒檢測患病組與健康組血清中CCL5的含量，檢測限為6.799～600 ng/L。采用人GM-CSF試劑盒檢測GM-CSF的含量，檢測限為32～500 pg/mL。嚴格按照試劑盒說明書配制相關濃度梯度的標準品、樣品稀釋液、底物A、反應液、顯色液以及終止液，并在規定時間內依次按順序添加，用酶標儀在波長450 nm處測定血清樣本的吸光度值，根據標曲計算血清CCL5與GM-CSF的濃度。

1.4.3 評價方法 采用新生兒神經行為測定(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)評分法評估新生兒出生后的第7天神經系統的發育情況。

1.4.4 隨訪 自HIE患兒出院后第1天為隨訪起點，隨訪期為12個月，進行格塞爾發育量表(Gesell developmental test scales，GDS)，GDS包括5個能區：適應性、大運動、精細動作、語言、社交，將HIE患兒5個能區的表現與健康者進行比較，得到每個能區的發育年齡，并計算發育商，發育商=(發育年齡/實際年齡)×100，即GDS。GDS總均值≥86分正常，76～85為可疑，≤75分為異常。以期滿作為隨訪終點，所有患兒均得到有效隨訪。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料均呈正態分布且方差齊，多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用

SNK

-

q

檢驗，兩組間均數比較采用

t

檢驗，計數資料以頻數表示，組間比較采用

χ

檢驗，相關性分析采用Pearson法。以

P

<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究對象一般資料比較 兩組研究對象年齡、性別、胎齡等一般資料進行比較，差異無統計學意義(

P

>0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2 兩組研究對象血清CL5、GM-CSF的表達水平及NBNA評分比較 兩組研究對象血清CCL5、GM-CSF表達水平及NBNA評分進行比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象血淸CCL5、GM-CSF表達水平及NBNA評分比較

2.3 不同嚴重程度HIE患兒血清CCL5、GM-CSF的表達水平及NBNA評分比較 不同嚴重程度組HIE患兒血清CCL5、GM-CSF表達水平及NBNA評分進行比較，差異均有統計學意義(

P

<0.05)，重度組HIE患兒血清GM-CSF表達水平、NBNA評分均低于中度組與輕度組，血清CCL5表達水平高于中度組、輕度組，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表3。

表3 不同嚴重程度HIE患兒血清CCL5、GM-CSF水平及NBNA評分比較

2.4 HIE患兒血清CCL5、GM-CSF表達水平與NBNA評分的相關性分析 HIE患兒血清CCL5與NBNA評分呈負相關(

r

=-0.318，

P

=0.002)，血清GM-CSF水平與NBNA評分呈正相關(

r

=0.338，

P

<0.001)；血清CCL5水平與GM-CSF水平呈負相關(

r

=-0.359，

P

<0.001)。見圖1～3。

圖1 CCL5表達水平與NBNA評分的相關性

圖2 GM-CSF表達水平與NBNA評分的相關性

圖3 CCL5表達水平與GM-CSF水平的相關性

2.5 HIE患兒預后狀況分析 根據HIE患兒CCL5、GM-CSF表達水平的平均值，將患兒分為高表達與低表達。39例CCL5高表達患兒的GDS評分為(80.67±4.28)分，43例CCL5低表達患兒的GDS評分為(86.14±3.70)分，差異均有統計學意義(

t

=6.206,

P

<0.001)。42例GM-CSF高表達患兒的GDS評分為(85.84±4.56)分，40例GM-CSF低表達患兒的GDS評分為(81.02±5.33)分，差異均有統計學意義(

t

=4.407,

P

<0.001)。

3 討論

HIE是常見的新生兒危重癥，一般在出生后72 h病情達到高峰，然后逐漸改善，但嚴重者病情會進一步惡化，嚴重影響新生兒的神經系統發育，且容易引發多種神經系統后遺癥。Chen等研究發現，HIE新生兒神經系統發育過程中多種細胞因子、趨化因子和黏附因子發生變化，推測HIE發生發展與多種因子有關。

CCL5作為CC亞家族趨化因子，以游離態形式存在于體內，相對分子質量較低，在神經系統中活化的T細胞、神經節、神經元、脂多糖等均可以刺激細胞分泌CCL5。本研究結果顯示，HIE患兒血清CCL5表達水平高于健康新生兒，提示血清CCL5表達升高可能參與HIE發病。Barbeau等研究發現，HIE患兒體內存在廣泛的炎癥反應，其中CCL5可誘導嗜堿性粒細胞釋放組胺，并激活嗜酸性粒細胞，但中、重度HIE患兒CCL5表達水平較輕度HIE穩定，提示通過檢測早期CCL5表達水平變化可更好區分HIE患兒的病情嚴重程度。本研究通過檢測不同嚴重程度HIE患兒血清CCL5發現，重度組患兒血清CCL5表達水平最高，其次為中度組，輕度組患兒血清CCL5表達水平最低，與Barbeau等研究類似，提示血清CCL5表達水平變化與HIE嚴重程度有一定關系。動物模型研究發現，小鼠腦缺氧缺血后CCL5水平顯著增加，經治療后水平下降，表明CCL5可反映腦損傷的程度。本研究結果顯示，HIE患兒NBNA評分較健康新生兒低，且與血清CCL5表達水平呈負相關，進一步提示血清CCL5可能作為評估HIE患兒腦損傷的指標之一。但對于其通過何種作用機制在疾病中發揮作用仍需后期深入分析。

GM-CSF是參與調節巨噬細胞譜系群體數量和功能的介質。相關研究證明，GM-CSF通過多種信號通路對中樞神經系統有著重要的保護功能，可促進粒巨噬細胞增殖、分化及功能成熟，提高宿主的防御能力。本研究結果顯示，HIE患兒血清GM-CSF表達水平較健康新生兒低，且病情越嚴重，其表達水平越低，提示檢測血清GM-CSF，可能有利于評估HIE發病及其病情嚴重程度情況。Spath等研究了在體內成熟的外周輔助性細胞中GM-CSF表達失調對中樞神經系統髓樣細胞的影響，發現抗原非依賴性GM-CSF的釋放可導致炎性髓細胞侵入中樞神經系統，從而引發嚴重的神經功能缺損。本研究結果顯示，血清GM-CSF表達水平與NBNA評分呈正相關，與血清CCL5表達水平呈負相關，提示血清GM-CSF表達水平降低及CCL5表達水平升高可能共同影響HIE患兒的神經發育，與Barbeau等研究基本一致。此外，本研究通過分析CCL5、GM-CSF高低表達與GDS評分的關系，發現CCL5高表達患兒GDS評分低于低表達患兒，GM-CSF高表達患兒GDS評分高于低表達患兒，提示CCL5、GM-CSF表達水平與HIE患兒預后存在一定關系，有可能成為HIE患兒預后預測的潛在指標。

綜上所述，HIE患兒血清CCL5表達上調，GM-CSF表達下調，二者呈負相關，均影響HIE患兒的預后，臨床可監測血清CCL5、GM-CSF表達水平，以便對患兒進行早期干預治療或改善預后狀況。本研究樣本量較小，初步分析了HIE患兒CCL5、GM-CSF表達水平，結果可能存在一定的局限性，下一步將繼續驗證研究CCL5、GM-CSF表達水平對HIE的具體作用機制。