難治性肺炎支原體肺炎患兒鼻咽抽吸物肺炎支原體DNA載量與其臨床癥狀的相關性

呂亞洲 耿巧玲 楊 紅

肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)是兒童呼吸道感染，尤其是社區獲得性肺炎的主要病原體之一，兒童肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)的發病率約占社區獲得性肺炎的10%～30%，其中18%需要住院治療。MPP可發生于兒童的各年齡段，主要臨床表現為高熱、氣促、持續性咳嗽，常伴有肺外系統損害，MPP是具有一定自限性的疾病，多數患兒可自行緩解，但部分患兒應用大環內脂類抗生素治療后仍高熱難退，臨床和影像學表現加重，導致閉塞性細支氣管炎、單側透明肺、支氣管擴張、壞死性肺炎等肺部后遺癥，即難治性肺炎支原體肺炎(refractory mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP)。RMPP的嚴重程度受MP毒力、耐藥性、感染負荷、宿主的免疫力等因素影響，局部MP載量可客觀反映MP與宿主免疫力之間的關系，故RMPP局部MP載量可能與病情嚴重程度密切相關，但檢測肺泡灌洗液操作具有創傷性，如果可以用鼻抽吸物代替，可有效提升患兒診療耐受能力。本研究對84例RMPP住院患兒進行鼻咽抽吸物MP-DNA檢測，旨在探討其表達水平與MPP臨床表現的相關性及對RMPP的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年3月南陽市中心醫院收治的84例RMPP患兒為研究對象，納入標準：①年齡3個月～12歲；②符合《諸福棠實用兒科學》中MPP診斷標準；③持續性發熱、咳嗽，肺部聽診可聞及濕性啰音；④X線胸片顯示肺部有浸潤影；⑤鼻咽抽吸物MP-DNA檢測陽性(MP-DNA拷貝數>400/mL)⑥應用大環內脂類藥物治療至少7 d，仍持續發熱(≥38.5℃)，臨床和影像學表現繼續加重的MPP。排除標準：①合并其它細菌或病毒感染；②原發性免疫功能缺陷者；③合并支氣管肺發育不良、支氣管哮喘、肺結核等其他肺部疾病；④合并腎臟、肝臟、心臟疾病；⑤合并腫瘤或其他系統疾病者。本研究經本院醫學倫理委員會批準，獲得患兒家長的知情同意并簽署知情同意書。入組患兒年齡3個月～12歲，平均(6.19±1.47)歲，其中男性53例，女性31例。根據鼻咽抽吸物中MP-DNA拷貝數，將患兒分為3組，拷貝數<10/mL的17例患兒為低表達組，拷貝數10/mL～10/mL的39例患兒為中表達組，拷貝數>10/mL的28例患兒為高表達組。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 所有患兒入院次日由經過專業訓練的護士進行標本采集，清潔鼻腔后，將一次性無菌吸痰管自鼻孔伸入約7～8 cm至咽喉部，用無菌負壓吸痰器吸引鼻咽抽吸物約2 mL。患兒入院次日行支氣管肺泡灌洗術，回收第一次灌洗液，用雙層無菌紗布過濾，然后3 500 r/min離心10 min，留取上清液，分裝后存于-80℃冰箱待檢。

1.2.2 MP-DNA定量檢測 采用熒光實時定量多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)進行MP-DNA定量檢測，試劑盒購于廣州中山大學達安基因股份有限公司，應用美國應用生物系統公司(Applied Biosystems) StepOnePlus定量PCR儀。①標本處理：將采集的鼻炎抽吸物標本置渦旋震蕩器上，震蕩2 min，充分混勻，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，留取沉淀。②DNA提取：向沉淀中加入50 μL核酸提取液B，充分混勻，100℃裂解10 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液4 μL進行PCR反應，引物由上海生工生物工程有限公司生產，上游序列為5'-FAAAGGATCCGGCAGAAATGCGTTGTAG-3'，下游序列為5'-AAAACTGCAGAACAATACCGAACTGACAGAA-3'。③PCR擴增：將試劑盒中的MP-PCR MIX、Taq酶系于室溫下融化，震蕩2 min，充分混勻，3 500 r/min離心30 s，按照試劑盒要求完成每個測試反應體系配制，PCR循環條件：94℃ 2 min，93℃ 30 s，55℃ 45 s，40個循環；94℃ 2 min，93℃ 30 s，56℃ 45 s，40個循環。④結果判定：反應結束后保存檢測數據，記錄儀器自動分析計算出的未知標本數值(Qty-Copies/mL)，若Ct值<38，則樣品MP-DNA含量(基因拷貝數/mL)=Qty-Copies/mL；若38

1.3 觀察指標 記錄3組患兒年齡、性別、發病至樣本采集時間、入院前β-內酰胺類使用率、入院前大環內酯類使用率、住院時間、臨床表現、實驗室和肺部影像學檢查結果。

2 結果

2.1 3組患兒一般情況比較 3組患兒入院前使用β-內酰胺類66例(78.57%)，入院前使用大環內酯類42例(50.00%)。3組患兒年齡、性別、發病至樣本采集時間、入院前β-內酰胺類和大環內酯類使用率比較，差異無統計學意義(

P

>0.05)，高表達組患兒住院時間長于中、低表達組(

P

<0.05)。見表1。

表1 3組患兒一般情況比較

2.2 3組患兒臨床表現比較 84例患兒中體溫>39℃ 57例(67.86%)，熱程≥10 d 37例(44.05%)，氣促37例(44.05%)，喘息14例(16.67%)，發紺35例(41.67%)，呼吸困難8例(9.52%)，呼吸衰竭6例(7.14%)，肺部濕啰音50例(59.52%)，肺部呼吸音減低18例(21.43%)，肺部哮鳴音10例(11.90%)。3組患兒總熱程、使用大環內脂類后熱程、熱程≥10 d及體溫>39℃的比例比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)；高表達組患兒總熱程、使用大環內脂類后熱程長于中、低表達組(

P

<0.05)，高表達組患兒熱程≥10 d及體溫>39℃的比例較高；3組患兒氣促、喘息、發紺、呼吸困難、呼吸衰竭、肺部濕羅音、肺部呼吸音減低及肺部哮鳴音的比例比較，差異無統計學意義(

P

>0.05)。見表2。2.3 3組患兒實驗室檢查結果比較 3組患兒淋巴細胞計數、淋巴細胞百分比、中性粒細胞計數、血小板計數、乳酸脫氫酶比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)；3組患兒白細胞計數、中性粒細胞百分比及血紅蛋白比較，差異無統計學意義(

P

>0.05)。見表3。

表2 3組患兒臨床表現比較

表3 3組患兒實驗室檢查結果比較

2.4 3組患兒肺部影像學檢查結果比較 84例患兒中單側肺病變33例(39.29%)，雙側肺病變51例(60.71%)，大片肺實變或肺不張23例(27.38%)，雙側或大量胸腔積液21例(25.00%)；3組患兒大片肺實變或肺不張、雙側或大量胸腔積液發生率比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)，其中低表達組患兒的發生率較低。見表4。

表4 3組患兒肺部影像學檢查結果比較[例(%)]

2.5 3組患兒肺泡灌洗液IL-4、IL-8、IFN-γ、TNF-α水平比較 3組患兒肺泡灌洗液IL-4水平比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)，其中低表達組最低，高表達組最高；3組患兒肺泡灌洗液IL-8、IFN-γ、TNF-α水平比較，差異無統計學意義(

P

>0.05)。見表5。2.6 MP-DNA與肺泡灌洗液IL-4、IL-8、IFN-γ、TNF-α的相關性 三組患兒鼻炎抽吸物MP-DNA載量分別為(18.95±9.27)Copies/mL、(4.72±1.98)Copies/mL和(4.03±1.65)Copies/mL，相關性分析顯示MP-DNA水平與肺泡灌洗液IL-4呈正相關(

r

=0.481，

P

<0.001)，與IL-8、IFN-γ、TNF-α無相關性(

r

=0.055、0.042、0.069，

P

=0.429、0.476、0.413)。見圖1。

表5 3組患兒肺泡灌洗液IL-4、IL-8、IFN-γ、TNF-α水平比較

3 討論

MP是一種介于病毒與細菌之間，缺乏細胞壁，可獨立存活的最小病原微生物，其以氣溶膠的形式進入呼吸道，依賴P1蛋白粘附在宿主氣道上皮細胞表面，將局部代謝產生的過氧化氫等物質排入細胞內，氧超載破壞細胞內觸酶的活性，造成纖毛破壞、脫落、細胞腫脹、壞死凋亡，而氣道上皮細胞壞死可引起局部的炎癥反應。機體的炎癥反應可清除病原體，起保護作用；同時，過度免疫炎癥反應可引起免疫損傷而加重病情，因此，直接侵襲和過度免疫炎癥反應被認為是MP感染的主要致病機制。與成人相比，兒童的免疫力和抵抗力相對較差，MP感染發生率較高，MP感染除引起呼吸系統疾病外，還可會對其他系統和器官造成免疫損傷，增加治療難度，危害兒童的身心健康。隨著PCR技術的發展，其逐漸被應用于MPP的診斷，既往呼吸道分泌物MP檢測陽性只能反映正常定植菌，不能代表侵襲致病菌，而鼻咽抽吸物MP-DNA檢測可真實反映呼吸道內MP感染數量。RMPP的發病機制至今尚無定論，以往多支持MP的吸附作用和直接侵入發病等學說，但更多的學者認為，RMPP可能與免疫炎癥損傷、MP載量、MP耐藥、MP分型、纖毛結構破壞等有關。

目前研究表明，MPP病情嚴重程度與MP感染負荷呈正相關，MP-DNA拷貝數定量檢測是反映MP感染負荷常用的實驗室檢查方法。本研究對84例住院MPP患兒進行了鼻咽抽吸物MP-DNA定量檢測，發現體溫>39℃ 57例，熱程≥10 d 37例，氣促37例，喘息14例，發紺35例，呼吸困難8例，呼吸衰竭6例，肺部濕羅音50例，肺部呼吸音減低18例，肺部哮鳴音10例；高表達組患兒住院時間、總熱程、使用大環內脂類后熱程長于中、低表達組，高表達組患兒熱程≥10 d及體溫>39℃的比例較高；提示MPP患兒MP感染數量越多，臨床癥狀可能越嚴重，住院時間越長，即MPP病情輕重可能與呼吸道分泌物MP載量有關，與袁紅霞等報道結果一致。

本研究結果顯示，高表達組患兒淋巴細胞計數、淋巴細胞百分比、血小板計數較低，中性粒細胞計數、乳酸脫氫酶較高，低、中、高表達組C反應蛋白水平呈升高趨勢；說明MPP患兒炎癥反應與MP感染數量有關，MP-DNA拷貝數越高，炎癥反應越強。其可能原因：MP感染數量越多，MP感染造成的呼吸道直接損傷越重，從而引起強烈的炎癥反應，因此，建議臨床早期應用大環內酯類抗生素或環丙沙星以控制MP感染，改善病情；除直接損害外，MP相關抗原能激活宿主免疫細胞，刺激驗證機制的釋放，MP感染數量越多，MP相關抗原表達量越多，引起的免疫炎癥反應越強。肺部影像學檢查結果顯示，單側肺病變33例(39.29%)，雙側肺病變51例(60.71%)，大片肺實變或肺不張23例(27.38%)，雙側或大量胸腔積液21例(25.00%)；高表達組患兒大片肺實變或肺不張、雙側或大量胸腔積液發生率較高；說明高表達組患兒肺部損傷較低、中表達組更嚴重。

本研究還發現，患兒鼻炎抽吸物MP-DNA表達水平與肺泡灌洗液IL-4呈正相關，與IL-8、IFN-γ、TNF-α無相關性；提示MP-DNA表達水平可能與MMP患兒Th1/Th2免疫應答有關，MP-DNA高表達可導致Th1/Th2偏移。IFN-γ主要由Th1細胞產生，在機體感染后的細胞免疫中發揮重要作用，其可活化巨噬細胞和單核細胞以清除MP，并促進細胞毒性NK細胞和T淋巴細胞發揮抗感染作用。IL-4主要由活化的肥大細胞和Th2細胞產生，主要介導體液免疫，還參與Th1/Th2免疫應答平衡。高表達組患兒肺泡灌洗液中IL-4水平明顯高于低、中表達組，提示高表達組患兒Th1/Th2免疫應答失衡更嚴重，Th2型細胞因子更占優勢。

綜上所述，MP-DNA表達水平與MPP住院患兒的臨床表現、Th1/Th2免疫應答有一定的相關性，MP-DNA高表達患兒肺部炎癥和肺內外損害可能更為嚴重，Th1/Th2免疫應答失衡，建議對MPP患兒進行MP-DNA定量檢測，為病情診斷和臨床治療提供參考依據。