阿帕替尼的抗腫瘤機制研究進展△

劉春浩，趙豪，李小毅

中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院基本外科，北京 100730

實體腫瘤生長需要大量的氧氣和營養維持，因此促使大量新生血管生成，促進腫瘤生長，進一步形成惡性循環。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為血管生成的主要調控因子，在多數惡性腫瘤中極為活躍。VEGF通過結合3種膜受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）調節內皮細胞功能：血管內皮生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）、VEGFR2和 VEGFR3。其中，VEGF的促血管生成作用主要由在血管內皮細胞上高表達的VEGFR2介導，因此，VEGFR2已成為腫瘤治療的重要靶點。

甲磺酸阿帕替尼是一種新型的高度選擇性靶向VEGFR2的小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）。作為一種抗血管生成藥物，阿帕替尼在多種實體腫瘤的治療中顯示出了一定的療效，已被批準用于晚期胃癌的治療。新近有研究提示其在碘難治性分化型甲狀腺癌的治療中取得了令人意外的良好療效。一系列靶向藥物治療的臨床研究似乎表明靶向藥物對VEGFR2親和力越高，其抗腫瘤作用越強，療效越好。相關的基礎研究表明阿帕替尼除了具有抗血管生成作用外，同樣能夠直接作用于腫瘤細胞發揮抗腫瘤作用，包括直接抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，逆轉腫瘤耐藥等。此外，阿帕替尼還能夠通過調節腫瘤免疫微環境發揮抑制腫瘤生長的作用。因此，本文綜述阿帕替尼的研究現狀，為進一步的研究與應用提供參考。

1 阿帕替尼主要作用靶點

VEGFR是一種膜受體酪氨酸激酶，有3種亞型：VEGFR1（Flt1）、VEGFR2（KDR）和 VEGFR3（Flt4），與VEGF結合后發揮調節內皮細胞功能的作用。作為最主要影響血管生成的受體，VEGFR2在大多數成人血管內皮細胞以及循環內皮祖細胞、胰管細胞、視網膜祖細胞、巨核細胞和造血細胞中表達，轉導VEGF的促血管生成信號，是生理和病理性血管生成中的關鍵信號轉導因子。VEGF是影響血管生成的主要限速因子，其主要有7種類型：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、胎盤生長因子（placenta growth factor，PLGF）、副痘病毒VEGFE和蛇毒VEGFF。在大多數人類實體腫瘤中，VEGFR2通常與VEGFR3組合在腫瘤血管內皮中高表達，同時多種腫瘤細胞也能表達VEGFR2，而且表達水平高于正常組織細胞。在VEGF和VEGFR2結合后，受體的羧基末端TK結構域會發生自磷酸化，從而導致下游促血管生成信號的轉導。阿帕替尼可通過結合細胞內三磷酸腺苷位點阻斷VEGFR2的自磷酸化，抑制多種信號轉導途徑：介導內皮細胞增殖的RAF/MEK/細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）途徑；與內皮細胞遷移有關的p38-促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑；與內皮細胞存活和血管通透性增加相關的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）途徑；從而有效抑制腫瘤新生血管內皮細胞的增殖、遷移，并可以降低血管通透性（圖1）。

圖1 阿帕替尼抑制VEGFR2信號通路抑制血管生成

2 阿帕替尼抗腫瘤機制

阿帕替尼最初是作為一種抗血管生成藥物應用于臨床，通過抑制腫瘤血管生成，發揮其抑制腫瘤生長的作用，但是不少的實驗研究表明，除了抗血管生成作用外，阿帕替尼同樣能夠直接抑制腫瘤細胞的增殖，并通過多種不同的信號通路發揮其抗腫瘤作用。此外，阿帕替尼還可以通過影響多藥耐藥基因的表達以及調節免疫微環境而發揮抗腫瘤作用。

2.1 直接抑制血管內皮細胞

作為抗血管生成藥物，在體外實驗中，阿帕替尼能夠以劑量依賴的方式抑制人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）增殖、遷移和脈管形成，阿帕替尼作用后HUVEC脈管形成能力較對照組明顯降低，抑制率可達80%。在肺癌、胰腺內分泌腫瘤、甲狀腺未分化癌和肝細胞肝癌的移植瘤模型中，給予阿帕替尼治療后，血管內皮標志物CD31/血小板-內皮細胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）的表達和微血管密度顯著降低，表明阿帕替尼能夠在體內減少腫瘤組織的血管生成，抑制腫瘤生長。這一過程主要涉及3條細胞內信號轉導通路：RAF/MEK/ERK 通 路 、p38/MAPK 通 路 、PI3K/AKT/MTOR通路。Zhou等通過蛋白質印跡法（Western blot）研究發現，阿帕替尼以劑量依賴性方式顯著降低HUVEC中VEGF誘導的ERK、p38、PI3K、AKT蛋白的磷酸化，在低氧條件下這種抑制更顯著；在免疫熒光實驗中，阿帕替尼組的熒光信號較對照組顯著降低，表明RAF/MEK/ERK、p38/MAPK和PI3K/AKT3條信號通路受到明顯抑制。

在阿帕替尼對新生血管作用的研究中，存在一個值得注意的現象：移植瘤在低劑量（60 mg/kg）阿帕替尼作用3～7天后，基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和 MMP9表達顯著下降，明顯減少了血管基底膜的降解、血管結構的破壞；同時，這一過程中阿帕替尼還顯著提高了腫瘤α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）陽性血管與陰性血管的比率（通過α-SMA可以染色定位血管內皮細胞周圍的周細胞，而周細胞缺乏通常是新脈管系統不成熟的表現）。這些現象表明低劑量阿帕替尼在一定時間窗內可以促進血管成熟及正常化，從而使血管完整性和功能得到改善。研究顯示，在此時間窗內阿帕替尼可以有效提高化療藥物的療效。但是使異常腫瘤血管正常化可能會增加腫瘤細胞的營養和氧氣供應，并且理論上可以加速腫瘤的生長，這一過程對于阿帕替尼抗腫瘤作用的影響可能需要進一步的研究去探索。

2.2 直接對腫瘤細胞的作用

2.2.1 直接抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡 研究發現，在膽管細胞癌、肝癌、骨肉瘤、結腸癌、胰腺癌和甲狀腺癌中，阿帕替尼可以通過作用于腫瘤細胞表面的VEGFR2，促進腫瘤細胞凋亡，發揮直接的抗腫瘤細胞作用（表1）。目前研究提示，這一作用主要涉及2條細胞內信號轉導通路：VEGFR2/PI3K/AKT/MTOR 和 VEGFR2/信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）/B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）。作為 VEGFR2下游的信號通路，PI3K可以被細胞表面的受體（VEGFR2）激活，形成 p-PI3K，p-PI3K 可以激活AKT和其下游效應因子MTOR，將各種生長因子和細胞因子的信號轉導給細胞，從而促進腫瘤細胞的增殖和侵襲。磷酸化的AKT可以作用于Bcl-2家族和caspase家族中的蛋白質，抑制細胞凋亡，進而導致過度的細胞生長和增殖。Bcl-2和Bcl-2相關蛋白X（Bcl-2 associated X，BAX）均屬于凋亡調節蛋白，Bcl-2能夠抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞存活，BAX能夠拮抗Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用，促進腫瘤細胞凋亡。caspase 9是線粒體凋亡途徑中的關鍵因素，激活的caspase 9可以進一步激活下游的caspase 3，進而導致腫瘤細胞凋亡。在肝內膽管細胞癌、肝癌和胃癌中阿帕替尼可以顯著下調VGEFR2/PI3K/AKT/MTOR信號通路中多種蛋白的磷酸化水平（p-VGEFR2、p-PI3K、p-AKT、p-MTOR），并改變凋亡相關基因的表達（促凋亡基因BAX、caspase 3，caspase 9的表達增加，以及抗凋亡基因Bcl-2的表達降低）而促進凋亡，直接抑制腫瘤細胞增殖。新近Yu等在甲狀腺癌中發現，阿帕替尼同樣能夠通過抑制VEGFR2/PI3K/AKT/MTOR信號通路抑制腫瘤細胞增殖（表2）。

表1 阿帕替尼直接作用于腫瘤細胞內的作用通路相關研究

在骨肉瘤中，阿帕替尼則是通過抑制VEGFR2/STAT3/Bcl-2信號通路促進腫瘤細胞凋亡。研究結果顯示在阿帕替尼作用組，STAT3表達較對照組顯著下降。作為許多致癌信號通路的匯合點，STAT3通過下游信號分子（如Bcl-2和細胞周期蛋白D1）參與調節細胞生長。

此外，在肝外膽管細胞癌和胃癌的研究中，一些研究者發現阿帕替尼能夠通過抑制VEGFR2/磷脂酶 C（phospholipases C，PLC）/ERK1/ERK2信號通路，抑制VEGF的產生，抑制VEGF/VEGFR2自分泌環，減弱VEGF/VEGFR2信號轉導，發揮抗腫瘤作用（圖2）。

圖2 阿帕替尼通過VEGFR2/PLC/ERK1/ERK2信號通路抑制腫瘤細胞VEGF/VEGFR自分泌環

2.2.2 抑制腫瘤細胞侵襲和轉移 上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）代表一種生物學程序，通常在生物體發育、傷口愈合和組織纖維化期間觀察到，在此過程中上皮細胞失去其細胞特性并獲得間充質表型，同時伴隨著細胞形態的急劇變化，細胞與細胞、細胞與基質黏附的喪失和重塑，而獲得遷移能力。該過程可被腫瘤細胞利用，使腫瘤細胞發生侵襲和轉移。在骨肉瘤細胞的研究中，Zheng等發現阿帕替尼能夠明顯抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，使腫瘤細胞上皮標志物E-cadherin表達升高，降低間質標志物（包括波形蛋白、N-cadherin）、轉錄因子Slug和MMP9的表達。同樣在膽管細胞癌中，阿帕替尼也可以顯著抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，抑制轉錄因子Slug、Snail1和MMP9的表達。上述蛋白是EMT的重要調控因子，在腫瘤細胞的遷移和侵襲中發揮著重要作用。由此可見，阿帕替尼可以通過抑制上述轉錄因子的表達，調控EMT抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。

2.2.3 抑制腫瘤細胞多藥耐藥基因的表達 多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是腫瘤治療中的主要問題之一，其影響著抗腫瘤藥物的治療效果。細胞膜ATP結合盒（ATP-binding cassette transporter，ABC）的廣泛表達會從腫瘤細胞中外排出化學藥物，這在削弱抗腫瘤藥物的療效中起著主要作用。迄今為止，在人類中已經識別出48種ABC蛋白，根據序列相似性將其分為7個亞家族（A～G）。3個轉運蛋白亞家族在腫瘤細胞的MDR產生中具有關鍵作用，包括ABC B成員1（ABCB1/MDR1）、C家族成員1（ABCC1/MRP1）以及G家族成員2（ABCG2/BCRP）。ABCB1有能力轉移多種化療藥物，如蒽環類、長春花生物堿、紫杉烷類。ABCG2可以排出不同的抗腫瘤藥物，如米托蒽醌和蒽環類、拓撲異構酶I抑制劑等。Liu等研究發現阿帕替尼以劑量依賴的方式抑制順鉑耐藥A549細胞（A549/DDP）中MDR1基因的表達，同時抑制ERK信號通路的活性，恢復A549/DDP細胞對DDP的敏感性。Mi等發現阿帕替尼可以通過直接抑制ABCB1和ABCG2功能，逆轉ABCB1和ABCG2介導的MDR，導致細胞內化療藥物濃度升高。一個值得注意的現象是，阿帕替尼在沒有明顯影響AKT和ERK信號通路的磷酸化情況下發揮了逆轉腫瘤耐藥的作用，一定程度上表明MDR的逆轉與酪氨酸激酶的阻斷無關。基于以上機制，阿帕替尼與其他常規化療藥物組合可能克服腫瘤化療中的化療耐藥。

2.3 免疫調節相關抗腫瘤機制

程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）是程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）的配體，其相互作用抑制T細胞功能并導致免疫逃逸。在骨肉瘤中，研究人員通過免疫組織化學檢測發現PD-L1主要在骨肉瘤細胞中表達，陽性率為35.5%（33/93），同時PD-L1的高表達與預后不良相關；體內外實驗顯示，阿帕替尼可通過抑制VEGFR2/STAT3信號通路，降低骨肉瘤細胞中PD-L1的表達，激活免疫調節作用，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲（圖3）。現已明確在肝細胞肝癌中NK細胞百分比的下降和功能障礙可促進腫瘤的進展。Liu等研究發現，阿帕替尼能夠增加肝細胞肝癌移植瘤中NK細胞的浸潤，增加腫瘤內NK細胞比例，顯著上調NK細胞上激活受體NK細胞組群2D受體（NK group 2D receptor，NKG2D）的表達，下調共抑制受體具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain，TIGIT）的表達，NK細胞活化標志物CD69和細胞毒性分子CD107a的表達明顯增強，表明阿帕替尼可以逆轉腫瘤細胞中的NK細胞功能障礙，抑制腫瘤生長。

圖3 阿帕替尼通過減少PD-L1的表達激活T細胞示意圖

另外，需要注意的一個問題是，阿帕替尼可能會增加腫瘤細胞的自噬，影響其抗腫瘤作用。自噬具有雙重作用，在早期自噬可以防止腫瘤的發生并抑制腫瘤進展；而在晚期腫瘤的低氧環境中，自噬能夠促進腫瘤的存活和生長，并促進腫瘤轉移，目前研究顯示聯合應用自噬抑制劑可以提高阿帕替尼的抗腫瘤效果。

綜上所述，除了抗血管生成作用外，目前的研究發現了阿帕替尼更多的抗腫瘤途徑，主要包括對腫瘤細胞的直接抑制作用及免疫調節等作用。這些作用主要涉及細胞內的多條信號通路，但是針對每一種腫瘤的臨床療效及機制需要進一步探討。