白藜蘆醇/富勒烯納米組裝體的制備
——在膽管支架抗炎涂層中的應用評估

高 建，劉永佳，戚曉亮，徐汪節，喬中東

（1.上海交通大學a.生命科學技術學院；b.分析測試中心，上海 200240；2.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院，上海 200011）

0 引言

膽管狹窄是膽道疾病患者高發病率和高死亡率的重要原因［1］。外科手術中的膽管受損、增生性膽管炎以及惡性腫瘤是導致膽道狹窄的主要原因，狹窄形成與成纖維細胞增殖、膠原蛋白沉積、纖維化和腫瘤生長有關。處置不當會引發胰腺炎，梗阻性黃疸等高風險疾病［2-3］。目前外科手術治療可以通過植入膽管支架直接改善膽道狹窄［4］。據統計，有30%的患者在第1次手術后出現了良性膽道狹窄，需要再次手術治療［5］。因此，降低術后增生性膽管炎的發生率和隨后的纖維化是一個具有挑戰性的問題。

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種天然多酚類黃酮，在不同的組織和器官中均表現出抗纖維化作用［6］。Res參與巨噬細胞的活化，抑制促炎基因的表達。Res具有激活Sirt1 和抑制炎癥的能力，Sirt1 會破壞TLR4/NF-kB/STAT 信號，從而降低巨噬細胞衍生的促炎因子產生［7］。膽管狹窄可通過Res洗脫球囊或支架來實現擴張［8］，但Res 直接作用于膽道狹窄部位的藥量有限，且膽汁會降低藥物作用濃度，但如果使用高濃度的Res又會帶來副作用。因此，研究能在膽管狹窄部位局部用藥并能持續緩慢釋放Res的藥物洗脫支架十分重要。

富勒烯（Fullerene，C60）作為一種強大的抗氧化劑，其中空分子結構可負載藥物，是一種潛在的藥物遞送載體。C60 可通過抑制肥大細胞和外周血嗜堿性粒細胞抑制促炎介質的釋放，達到抗炎作用［9］。

本文運用分子自組裝技術將具有抗炎功能的Res和C60 組裝成納米結構，并選取聚氨酯（Polyurethane，PU）這一力學強度、生物相容性良好的高分子材料做載體，并將該納米組裝體負載PU中，研究其用于膽管支架抗炎涂層領域的可能性。

1 材料與方法

1.1 試 劑

主要試劑：Res和C60 購于SIGMA公司，異丙醇、間二甲苯、PU、購于常熟市楊園化工有限公司。細胞培養基（RPMI1640）固體粉末購買于Gibco 公司，胎牛血清（FBS）購于四季青公司。人臍靜脈內皮細胞系（HUVECs）購于中科院上海細胞所。

1.2 試驗方法

1.2.1 Res/C60 納米組裝體的制備

配制2 mg/mL的Res異丙醇溶液和6 mg/mL C60間二甲苯溶液。Res 溶液與C60 溶液以不同體積比（2∶1，3∶1，5∶1，10∶1）混合，立即將混合液置于超聲儀（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）中，室溫超聲20 min，4 ℃冰箱靜置過夜，留存待用。混合溶液于5 000 r/min離心后，取沉淀風干后獲得Res/C60 組裝體粉末。

1.2.2 載Res/C60 的PU（PU-Res/C60）涂層制備

稱取3 g PU，溶于20 mL 四氫呋喃，室溫超聲20 min，制成15%的PU 溶液。將不同體積（1，2，3 mL）的選定納米組裝體溶液加入相應體積（9，8，7 mL）的15%PU溶液中，渦旋30 min，制成含有納米組裝體溶液體積比10%、20%、30%的載納米組裝體的PU混合溶液。打開自動涂膜機（AFA-II，魅宇儀器），預熱至70 ℃，將12 mL混合溶液傾倒在無塵玻璃板一端，用200 nm的金屬滾動涂膜器將溶液緩慢滾動成20 cm×10 cm薄膜，將玻璃板放置在通風櫥風干，待溶劑完全揮發，揭下薄膜涂層待用。

1.3 Res/C60 納米組裝體理化性能表征

（1）不同投料比例的Res/C60 納米組裝體表面形貌和直徑分布。將Res/C60 納米組裝體溶液分別滴在潔凈硅片上，保持表面潔凈，置于通風櫥中過夜讓溶劑揮發。樣品表面做噴金處理，使用掃描電子顯微鏡（SEM，Sirion 200，FEI）觀察形貌。Nano Measurer 軟件隨機選擇100 個組裝體來計算組裝體平均直徑分布。

（2）Res、C60 和Res/C60 納米組裝體的表面形貌。將6 mg/mL的C60 間二甲苯溶液與2 mg/mL 的Res異丙醇溶液以體積比1∶3混合；純Res溶液加入相同比例的間二甲苯，純C60 溶液加入相同比例的異丙醇。將上述3 種溶液分別混合，室溫超聲20 min，4 ℃冰箱靜置過夜。同樣條件下經掃SEM 觀察納米組裝體的表面形貌。

（3）拉曼光譜分析。將純Res、C60 和Res/C60組裝體粉末分別用鑷子挑取少量置于干凈的硅片上，用玻璃片壓平，用色散型共聚焦拉曼光譜儀（Senterra R200-L，Bruker Optics）進行測試。

（4）X-射線衍射圖分析。分別取Res、C60 和Res/C60 粉末用多功能X 射線衍射儀（D8 ADVANCE Da Vinci，Bruker）進行測試。測試條件為40 kV、40 mA和掃描范圍2θ=3°～50°。

1.4 PU-Res/C60 涂層的機械性能評價

載藥納米組裝體PU涂層的機械性能通過拉伸測試儀（H5K-S，Hounsfield，UK）進行測定。將樣品膜裁成50 mm×10 mm 的平行樣品，兩夾具之間間距為30 mm，以10 mm/min 的速度進行拉伸。每個樣條平行測試5 次。

1.5 PU-Res/C60 涂層的藥物緩釋實驗

藥物緩釋過程采用動態透析法進行研究，具體過程為：取PU-Res/C60 涂層20 mg 置于透析袋中（截留相對分子質量為3.5 kD）。將透析袋浸沒在10 mL PBS（0.2 mol/L，pH 7.4）中，放置在搖床中震蕩（設定溫度為37°C，速度為120 r/min）。一定時間間隔后，將透析袋外液體全部移除，重新加入10 mL PBS（0.2 mol/L，pH 7.4）。收集不同時間點的透析液并離心（5 000 r/min）保管上清，取2 mL上清用2 mL無水乙醇稀釋，用紫外分光光度計測定305 nm處藥物的特征紫外吸收值。用PBS與無水乙醇體積比為1∶1為溶劑，測定一系列已知濃度的Res溶液紫外吸收值，獲得Res標準曲（Y=0.013 03+0.129 63X，R2=0.999 8）。透析液中Res的濃度通過標準曲線計算得出。將組裝體溶液離心取上清，通過測得上清液中殘留的Res濃度，計算得組裝體溶液載藥量為8.35%，包封率為20.75%。

1.6 MTT法測定細胞活性

選用HUVECs 進行Res/C60 納米組裝體的MTT（methyl-thiotetrazole）法細胞毒性評價。96 孔板中鋪入1 ×104個細胞/孔，用含10%胎牛血清RPMI1640培養基在含5%CO2和37℃培養12 h。加入Res、C60和組裝體藥物保持其終濃度為10 μg/mL，繼續培養48 h。按MTT 試劑盒進行后續操作，用酶標儀（Multiskan MK3；Thermo Labsystems）在492 nm 下測量吸光度。取6 個平行樣品的平均值。

1.7 白藜蘆醇清除DPPH自由基能力的評價

取0.1 mL 不同濃度（10，20，30，40，50，80，100 μg/mL）梯度的Res、C60 和Res/C60 納米組裝體溶液分別同1.0 mL 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）乙醇溶液混勻，DPPH 乙醇溶液為空白樣液，于37 ℃反應60 min 后在波長517 nm比色，DPPH 自由基清除率D采用如下公式計算。

1.8 Res/C60 納米組裝體的抗炎效果評價

（1）原代樹突狀細胞的提取。選取6～8 周齡的C57BL/6 小鼠，頸椎脫臼處死，用注射器反復吸取無菌的PBS緩沖液沖洗出骨髓腔中細胞，1 000 r/min離心10 min后，取細胞沉淀，接種于培養皿中，加入終濃度為100 ng/mL 脂多糖（LPS）刺激骨髓造血細胞成熟，培養的第3 天半量換液，第5 天全量換液，第7 天得成熟的樹突狀細胞。

（2）Res/C60 納米組裝體對炎癥因子抑制效果評價。將樹突狀細胞以1 ×104個細胞/孔的密度接種于24 孔板中，培養12 h 待細胞完全貼壁后，設定實驗分組為空白對照（培養基）、LPS 陽性對照和Res/C60 納米組裝體，陽性組和組裝體組分別加入50 μL LPS 溶液，保持其終濃度為100 ng/mL，組裝體組加入50 μL組裝體原液，其余組用相同體積培養基補齊，培養12 h后通過檢測細胞中白細胞介素1（IL-1），白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的mRNA的表達水平來評價納米組裝體的抗炎效果。數據統計P ＜0.05。

1.9 數據統計

以上所有實驗都至少做3 次平行，通過使用單向方差分析比較數據獲得統計學上的顯著性差異。數據表示為平均值±SD，統計學顯著性標準為P ＜0.05。

2 結果與討論

2.1 Res、C60 和不同比例納米組裝體的表面形貌及直徑分布

觀察Res、C60 和Res/C60 納米組裝體的表面形態。純Res呈花瓣樣片狀，純C60 呈細長的棒狀，截面為規整的六邊形，兩者通過分子自組裝技術組裝后，為短棒狀，且棱柱的棱角更圓潤。

Res溶液與C60 溶液以體積比3∶1混合后得到的組裝體（Res/C60-3∶1），直徑分布在250～450 nm，標準差值最小，說明這種比例下的組裝體尺寸分布均勻，為最佳的Res/C60 組裝體的投料比，文中提到Res/C60 組裝體均采用此種制備條件。

圖1 Res（a）和C60（b）和組裝體（c）Res/C60-2∶1，（d）Res/C60-3∶1，（e）Res/C60-5∶1，（f）Res/C60-10∶1的表面形貌和直徑分布

2.2 拉曼光譜及X-射線衍射圖

拉曼光譜反映分子的振動頻率信息，可用于分析物質的組分和結構。圖2（a）拉曼光譜圖譜中有較強的C60 信號峰，同樣可以說明組裝體中存在C60，組裝體中新生成的峰可能由于兩者組裝形成。

圖2（b）X-射線衍射圖譜顯示，純Res 高度結晶，并在2θ 的范圍觀察到以16.31°、19.14°、22.39°、23.56°、25.16°、28.26°的尖銳的衍射峰，說明了Res是晶體性質。此外，在Res/C60 的組裝體上也出現了部分Res和C60 疊加的特征峰。說明Res與C60 組裝成功，且大部分是包括在C60 分子內部，因此未顯示出強烈特征性的尖峰。

2.3 PU-Res/C60 涂層表面形貌分析

圖2 Res、C60和Res/C60納米組裝體的拉曼光譜圖和X-射線衍射圖譜

圖3 （a）裸支架、覆膜支架和擴張后的覆膜支架，（b）覆膜支架SEM圖，（c）、（d）分別為裸支架SEM圖和EDS能譜，（e）、（f）分別為覆膜支架的SEM圖和EDS能譜圖

從圖3（a）、（b）可觀察出，該覆膜彈性良好，擴張后有足夠的柔韌性和強度來支持臨床使用。比較圖3（c）～（f）可知，覆膜的金屬支架對應的能譜圖中（c）、（d）含量升高，驗證了PU-Res/C60 涂層的成功涂覆。

2.4 PU-Res/C60 涂層薄膜的力學性能評價

載藥納米涂層薄膜的機械性能是其在生物醫學工程領域應用的重要因素。圖4（a）中所有樣品均呈現較好的彈性，隨著載藥量的增加，PU-Res/C60 涂層薄膜的最大斷裂強度逐漸增加。如圖4（b）所示，PURes/C60 涂層薄膜的彈性模量較純PU膜大，且隨著載藥量的增加與增大的趨勢。機械性能的結果表明，在PU中載入Res/C60 納米組裝體后形成的涂層薄膜，彈模量增加，彈性稍有降低，但總體滿足其應用需求。

圖4 載有不同藥量的納米組裝體涂層薄膜的機械性能

2.5 PU-Res/C60 涂層薄膜的藥物緩釋實驗和Res/C60 納米組裝體的自由基清除能力

從圖5（a）可看出，PU-Res/C60-10%納涂層在30天后釋放出約63%的Res藥物，相比較，PU-Res/C60-20%和PU-Res/C60-30%納米組裝體涂層僅釋放出約45%和39%，比PU-Res/C60-10%納米組裝體涂層藥物釋放得更加緩慢，能夠持續發揮藥效。

通常，聚合物載藥體系在藥物緩釋初始階段易形成藥物突釋現象，隨后藥物以相對穩定的緩釋速度持續釋放［10］。PU-Res/C60 涂層在第1 天的藥物緩釋實驗中藥物累積釋放量最高達20%左右，在30 天的長周期內PU-Res/C60-10%涂層能夠持續累積釋放60%左右的藥量。由于白藜蘆醇不溶于水，故其在血液中的半衰期較短，生物利用度低，不能長時間對免疫細胞產生抗炎作用［11］，所以需要設計Res 藥物緩釋系統，達到藥物持續釋放和在較長時間內發揮抗炎效果。本研究設計的PU-Res/C60 納米組裝體涂層，可以通過添加不用含量的Res/C60 納米組裝體來實現不同載藥量的需求，Res 與C60 形成的自組裝結構，再與PU形成涂層，兩者都有助于控制其藥物釋放速度，使其在長時間內可達到藥物持續釋放的目的。

羥自由基作用于體內蛋白質、核酸、脂類等生物分子，造成細胞結構和功能損傷，易引發炎癥反應，羥自由基清除能力是樣品抗氧化能力的重要指標。據圖5（b）可知，Res、C60 和Res/C60 納米組裝體這3 種物質的羥自由基清除能力隨濃度增大逐漸成上升趨勢。組裝體濃度達100 μg/mL時，有50%以上的自由基清除率。

圖5 （a）PU-Res/C60 涂層在PBS 緩沖液（pH 7.4）中的體外藥物釋放曲線；（b）Res、C60和Res/C60納米組裝體的自由基清除能力

2.6 Res、C60 和Res/C60 納米組裝體對體外細胞存活率的影響及其抗炎效果評估

如圖6（a）所示，各實驗組在培養48 h 后，HUVECs存活率均在90%以上，說明Res、C60 和Res/C60 納米組裝對正常細胞毒性較低，有較好的生物相容性。

通過對與組裝體共培養12 h 后的炎癥因子的表達水平進行研究，發現LPS 炎癥因子出現明顯下降，如圖6（b）所示，IL-1，IL-6，TNF-α 3 個代表性的炎癥因子，在LPS誘導下表達量顯著上升，在持續的Res釋放條件下，3 種炎癥因子的mRNA 表達水平受到明顯抑制。

圖6 MTT法測定Res/C60 納米組裝體48 h 后HUVECs 的存活率；Res/C60納米組裝體孵育12 h后各炎癥相關基因的mRNA表達水平

有研究發現Res可以減少巨噬細胞中IL-1 和IL-6的表達［12］，而IL-1 和IL-6 表達量增加說明細胞處在促炎狀態［13］。在慢性膽道梗阻所致大鼠肝損傷動物模型實驗中［14］，Res 具有顯著性保護作用，可抑制導管增生和淋巴細胞炎癥，能很好抑制組織中慢性疾病有關的低度炎癥狀態［15］。同時，Res 可用作膽道梗阻的保護劑，治療膽管結扎后的肝功能受損，減少凋亡細胞數量［16］。本實驗中Res 表現出與上文一致的抗炎效果，說明納米組裝體對炎癥因子的釋放有明顯的抑制作用。

3 結語

本文基于分子自組裝技術得到Res/C60 納米組裝體，在此基礎上研究了該組裝體的理化性能與其應用于藥物洗脫支架的可能性。更進一步運用PU作為組裝體載體，制備得到PU-Res/C60 涂層，驗證了其在膽管支架抗炎涂層領域的應用。Res/C60 納米組裝體具有良好的藥物緩釋性能、低毒性和抗炎功能，且在膽管支架抗炎涂層領域有一定的應用前景，未來有希望用于臨床改善膽管炎性狹窄。