高分辨氣質(zhì)聯(lián)用法的實(shí)驗(yàn)課程建設(shè)

王 慧，燕少瑋

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150090）

0 引言

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）由于具有靈敏度高、選擇性好、分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)逐步成為環(huán)境領(lǐng)域中非常重要的分析方法［1-5］。常規(guī)方法中通常用電子轟擊電離源（EI）結(jié)合單四級(jí)桿質(zhì)量分析器，這導(dǎo)致方法的分辨率較差，且目標(biāo)物的分子離子峰經(jīng)常在電離過(guò)程中丟失，為分析復(fù)雜基質(zhì)中的痕量目標(biāo)物帶來(lái)很大的難度。低能量電子轟擊電離源（LE-EI）結(jié)合高分辨氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-QTOF-MS）可以很好地解決上述問(wèn)題，它不僅提高了方法的選擇性和靈敏度，而且可以降低假陽(yáng)性結(jié)果的概率。此外，高分辨質(zhì)譜支持結(jié)構(gòu)測(cè)定，可以推斷未知物的化學(xué)元素和分子式。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究生需要應(yīng)用高分辨質(zhì)譜完成他們的科學(xué)研究。

結(jié)合環(huán)境學(xué)科的特點(diǎn)和研究生科研項(xiàng)目的需求，2018 年我校環(huán)境學(xué)院在研究生綜合實(shí)驗(yàn)課程中，開(kāi)設(shè)了“高分辨氣質(zhì)聯(lián)用法分析環(huán)境樣品中的林丹”實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展響應(yīng)了學(xué)校提出的以大型精密儀器為教學(xué)平臺(tái)，結(jié)合經(jīng)典實(shí)驗(yàn)樣品或?qū)W科前沿內(nèi)容，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)教學(xué)的教改思路。本實(shí)驗(yàn)以低能量電子轟擊離子源結(jié)合高分辨氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為核心內(nèi)容，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和條件優(yōu)化使學(xué)生了解高分辨氣質(zhì)聯(lián)用儀的工作原理，熟悉定性和定量等分析檢測(cè)技術(shù)，掌握環(huán)境樣品常用預(yù)處理方法的具體操作。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案

1.1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的選取

在儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，選取合適的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容非常重要［6-9］。內(nèi)容的設(shè)計(jì)不僅要著眼于學(xué)生的知識(shí)與技能的培養(yǎng)，還要兼顧學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，重視學(xué)生的感受，使其能在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中充分展示主動(dòng)性和創(chuàng)造性。

長(zhǎng)期的教學(xué)實(shí)踐表明，與實(shí)際生活相關(guān)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及學(xué)科前沿內(nèi)容，往往更能引起學(xué)生的興趣，同時(shí)還能培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維能力和科研敏銳度。基于以上考慮，選取“環(huán)境樣品中的林丹”作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。林丹作為典型的持久性有機(jī)污染物在媒體中常見(jiàn)報(bào)道，能極大地吸引學(xué)生的興趣［10］。同時(shí)，該物質(zhì)在環(huán)境科學(xué)研究中具有重要意義，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)內(nèi)容［11-13］。

1.2 實(shí)驗(yàn)基本原理

高分辨氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是指氣相色譜（GC）結(jié)合四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（QTOF-MS）技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了GC的高效分離能力和QTOF-MS的高靈敏度、高分辨率和極強(qiáng)的選擇性分離檢測(cè)技術(shù)。GC-QTOF-MS 樣品分析過(guò)程包括兩步：①待測(cè)樣品通過(guò)進(jìn)樣口加熱氣化后進(jìn)入GC，通過(guò)在流動(dòng)相和固定相間反復(fù)交換，待測(cè)樣品中的不同成分由毛細(xì)管柱分離；②從GC 流出的被分離組分依次進(jìn)入離子源被離子化，先在四級(jí)桿質(zhì)量分析器中根據(jù)質(zhì)荷比進(jìn)行分離，再根據(jù)離子在飛行管中的飛行時(shí)間推算離子的精確質(zhì)量，具有相同質(zhì)荷比的離子會(huì)同時(shí)到達(dá)檢測(cè)器，檢測(cè)器將離子信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，傳送至數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)譜儀的離子源是低能量電子轟擊電離源，該離子源與化學(xué)電離源類(lèi)似，為“軟”電離源，可以降低化合物在電離過(guò)程中發(fā)生分解的概率，通常僅丟失一個(gè)電子，產(chǎn)生M+準(zhǔn)分子離子，便于進(jìn)行分子量確認(rèn)。多級(jí)質(zhì)譜分析則是以六級(jí)桿作為碰撞池，使準(zhǔn)分子離子與氮分子在碰撞池中發(fā)生碰撞，進(jìn)而多級(jí)裂解獲得子離子碎片，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知物的高質(zhì)量定性分析。

分析環(huán)境樣品中的痕量物質(zhì)最大的挑戰(zhàn)，即富集目標(biāo)物濃度使其大于儀器分析的檢出限，因此樣品的預(yù)處理過(guò)程是GC-QTOF-MS 分析的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，樣品處理效果的好壞直接影響后續(xù)儀器測(cè)試所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。環(huán)境樣品的預(yù)處理方法很多，有液液萃取、固相萃取、固相微萃取法、快速溶劑萃取、微波輔助萃取和超聲輔助萃取等［14-16］。其中，固相萃取法（SPE）和快速溶劑萃取法（ASE）由于萃取效率高、有機(jī)溶劑使用量少、分離操作時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)在環(huán)境領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛。ASE是一種在較高壓力和較高溫度下，用常規(guī)溶劑對(duì)固體樣品進(jìn)行萃取的前處理方法。增加溶劑的溫度能夠加速目標(biāo)物的萃取，壓力的增加能夠使溶劑的沸點(diǎn)也相應(yīng)地增加，從而使溶劑在萃取的過(guò)程中始終保持液態(tài)，進(jìn)而在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中痕量目標(biāo)物的高效萃取。SPE是一種基于吸附劑的萃取技術(shù)，其基本原理類(lèi)似于液相色譜，吸附劑作為固定相，而液態(tài)樣品作為流動(dòng)相。當(dāng)樣品通過(guò)萃取柱時(shí)，流動(dòng)相中目標(biāo)物被保留在吸附劑上，雜質(zhì)和共萃取物通過(guò)淋洗等方法去除，隨后選擇合適的溶劑將目標(biāo)物洗脫下來(lái)，從而達(dá)到目標(biāo)物分離、凈化和濃縮的目的。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

實(shí)驗(yàn)儀器：美國(guó)安捷倫氣相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀、美國(guó)SUPELCO 固相萃取裝置、美國(guó)賽默飛ASE-350 快速溶劑萃取儀、德國(guó)默克密理博Milli-Q IQ 7000 超純水系統(tǒng)、精密電子天平。

實(shí)驗(yàn)耗材和試劑：甲醇、正己烷、二氯甲烷均為色譜級(jí)、C18 固相萃取柱（Waters Oasis 6 mL，200 mg）。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）環(huán)境樣品的制備。在農(nóng)場(chǎng)采集土壤樣品（50 g），加入適量的林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在土壤中的濃度為0.2 μg/g，隨后將加標(biāo)土壤混勻，通風(fēng)櫥中放置24 h，待溶劑完全揮發(fā)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在松花江流域采集地表水（1 L），經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后加入適量的林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在環(huán)境水中的濃度為0.5 μg/L。

（2）土壤樣品快速溶劑萃取。稱取2 g樣品放入萃取罐，以正己烷作為萃取溶劑，溫度設(shè)置為80 ℃，預(yù)熱時(shí)間5 min，靜態(tài)萃取10 min，循環(huán)2 次，潤(rùn)洗池體積60%，潤(rùn)洗時(shí)間60 s。待萃取完成后。將上述所得的萃取液用氮吹儀濃縮至低于0.8 mL，加入正己烷定容至1 mL。所得的溶液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后用于GC-QTOF-MS分析。

（3）地表水樣品固相萃取。依次用4 mL 甲醇和5 mL超純水對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化。將100 mL加標(biāo)水樣泵入活化后的固相萃取柱，通過(guò)活塞和真空泵控制流速為5 mL/min。再用超純水對(duì)固相萃取柱進(jìn)行凈化以去除其他雜質(zhì)。在60 kPa壓力下，用氮?dú)飧稍锕滔噍腿≈? min。將5 mL 甲醇泵入固相萃取柱，將C18吸附的目標(biāo)物洗脫下來(lái)，通過(guò)活塞和真空泵控制流速為1 滴/s。將上述所得的洗脫液用氮吹儀濃縮至低于0.2 mL，加入二氯甲烷定容至1 mL用于GC-QTOFMS分析。

（4）氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀運(yùn)行條件。氣相色譜使用Agilent 7890B系統(tǒng)，色譜柱為Agilent HP-5M毛細(xì)管柱（φ0.25 mm×30 m，0.25 μm）；柱箱初始溫度120 ℃保持2 min，隨后以10 ℃/min的速度升溫至300 ℃。進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流模式進(jìn)樣；進(jìn)樣體積1 μL；高純氦氣為載氣，流速為1.2 mL/min。

高分辨質(zhì)譜采用Agilent 7250 四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，離子源為低能量電子轟擊離子源，能量15 eV；高純氮?dú)鉃榕鲎矚猓魉贋?.5 mL/min；掃描方式為全掃描，掃描范圍50～500 amu。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 定性分析

首先分析林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液（250 μg/L），圖1（a）所示為林丹的高分辨質(zhì)譜總離子流圖（TIC）。林丹的高分辨質(zhì)譜圖如圖1（b）所示，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比m/z，縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度，得到了m/z=180.937 0 和182.934 2這兩個(gè)特征離子峰，將特征離子輸入NIST17 譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得目標(biāo)物分子結(jié)構(gòu)式。以質(zhì)譜峰的保留時(shí)間和特征離子碎片作為定性依據(jù)，對(duì)環(huán)境樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性分析，并引導(dǎo)學(xué)生使用NIST17 譜庫(kù)對(duì)樣品萃取液中的未知物進(jìn)行定性。

選擇離子譜圖（EIC）可以有效降低復(fù)雜基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物定性的干擾。如圖1（c）所示，與TIC 相比，EIC可以將目標(biāo)物的檢出限降低10 倍。在分析土壤樣品萃取液時(shí)，共萃取物較多，對(duì)林丹的分析造成了一定的干擾，學(xué)生應(yīng)用EIC 選擇性地考察感興趣的離子（180.937 2 和182.934 2），很好地解決了這一問(wèn)題。

圖1 林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液分析結(jié)果

為激發(fā)學(xué)生興趣，可鼓勵(lì)學(xué)生優(yōu)化離子源電離能量值，并考察電子轟擊能量對(duì)方法靈敏度的影響。當(dāng)設(shè)置電離能量為15 eV時(shí)，得到的離子碎片較少，基峰峰高比電離能量為70 eV時(shí)要低。但在分析環(huán)境樣品中的痕量目標(biāo)物時(shí)，較低的電離能量能夠有效降低基線噪聲，提高方法的靈敏度。

2.2 定量分析

常用的定量方法包括外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。在實(shí)驗(yàn)前的課堂提問(wèn)中發(fā)現(xiàn)，約69%的同學(xué)僅了解內(nèi)標(biāo)法這一概念，從未具體應(yīng)用過(guò)。本實(shí)驗(yàn)將外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比，加深學(xué)生對(duì)定量方法的理解，并掌握兩種方法的具體操作步驟。

（1）外標(biāo)法。用二氯甲烷對(duì)林丹儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，獲得一系列濃度范圍為5～500 μg/L 的林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液。將配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液用GC-TOF-MS 進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）內(nèi)標(biāo)法。以13C 六氯苯作為內(nèi)標(biāo)物。用二氯甲烷對(duì)林丹儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，獲得一系列濃度范圍為5～500 μg/L的林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液。在不同濃度的林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液中，添加等量的內(nèi)標(biāo)物，使13C 六氯苯在一系列林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度均為250 μg/L。將配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液用GC-TOF-MS進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中林丹和13C六氯苯的濃度比值為橫坐標(biāo)，以林丹和13C六氯苯的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法獲得的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示。學(xué)生通過(guò)比較兩條曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）可知，在5～500 μg/L的濃度范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法的線性相關(guān)系數(shù)較高，因?yàn)樗苄?zhǔn)樣品基質(zhì)、進(jìn)樣偏差和基線漂移等干擾因素引入的誤差。

圖2 外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比

方法的檢出限和定量下限分別由信噪比的3 倍信號(hào)和10 倍信號(hào)所對(duì)應(yīng)的濃度值得出。在土壤樣品萃取液和地表水樣品洗脫液中添加內(nèi)標(biāo)物，隨后用GCTOF-MS進(jìn)行分析，將峰面積帶入內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，獲得林丹在環(huán)境樣品中的濃度值，并計(jì)算方法的精密度和準(zhǔn)確度。相關(guān)定性和定量分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 定性和定量分析結(jié)果

2.3 “未知物”分子式的判定

在定性分析地表水萃取溶液時(shí)，基質(zhì)中有一個(gè)明顯的質(zhì)譜峰m/z=201.976 1（見(jiàn)圖3）。將該物質(zhì)作為共萃取的未知物，對(duì)其分子式進(jìn)行推斷，具體步驟為：①學(xué)生在定性分析軟件“生成分子式”中輸入精確分子量，同時(shí)選擇失去一個(gè)電子模式，選擇可能包含的元素C，H，N，O，S，Cl，由軟件自動(dòng)生成可能的分子式；②由于目標(biāo)物為不飽和結(jié)構(gòu)，碳的個(gè)數(shù)≤（2n +2）氫的個(gè)數(shù)，將誤差限制在7.5 ×10-6；③如果化合物含有的氮分子為奇數(shù)，那么化合物的分子量也為奇數(shù)，目標(biāo)物的分子量為201.976 7（電子質(zhì)量為0.000 55 u），可見(jiàn)其含有偶數(shù)個(gè)氮，學(xué)生可以排除含有奇數(shù)個(gè)氮分子的分子式；④X+1 同位素（13C）的相對(duì)強(qiáng)度可以用來(lái)估計(jì)分子中碳的數(shù)量，即13C 的相對(duì)強(qiáng)度（%）=1.1 ×碳的數(shù)量，m/z=202.978 5 相對(duì)于m/z=201.976 1 為5.7%，由此推斷碳的數(shù)量為5～6；⑤自然界中35Cl和37Cl存在比例為3∶1，因此如果目標(biāo)物的分子式中含有1 個(gè)氯，那么同位素X +2 的相對(duì)強(qiáng)度應(yīng)為33.3%，未知物同位素X+2 的相對(duì)強(qiáng)度為34.5%，這意味著含有1 個(gè)氯元素；⑥自然界中34S 相對(duì)32S 的豐度為4.6%，排除了分子式中含硫的可能性。

圖3 未知化合物基峰及其同位素質(zhì)譜峰的相對(duì)強(qiáng)度

經(jīng)過(guò)以上推斷，獲得最可能的分子式為C6H3ClN2O4。學(xué)生將其輸入化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得化合物名稱為“二硝基氯苯”，通過(guò)NIST 17 譜庫(kù)進(jìn)行特征離子碎片比對(duì)，進(jìn)一步證實(shí)該未知物為二硝基氯苯。

3 教學(xué)實(shí)踐要點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)內(nèi)容多，注意事項(xiàng)多，影響因素多。而且大部分一年級(jí)的研究生在本科階段接觸大型儀器較少，同時(shí)對(duì)樣品預(yù)處理方法不熟悉，因此很難在短時(shí)間內(nèi)既能掌握儀器原理和操作，又能牢記分子式判定規(guī)則，同時(shí)完成實(shí)際樣品的快速分析。因此，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，鼓勵(lì)學(xué)生利用思維導(dǎo)圖構(gòu)筑課堂筆記和實(shí)驗(yàn)記錄。學(xué)生可以在有效的時(shí)間內(nèi)將教師在課堂上所講的內(nèi)容完整地體現(xiàn)在思維導(dǎo)圖中，有助于其課后在大腦中還原課上所學(xué)內(nèi)容。利用思維導(dǎo)圖來(lái)幫助分析，可以提高學(xué)生對(duì)高分辨氣質(zhì)聯(lián)用分析的認(rèn)知能力（見(jiàn)圖4）。而且，思維導(dǎo)圖能夠?qū)⒀芯可C合實(shí)驗(yàn)中多個(gè)單元的學(xué)習(xí)內(nèi)容進(jìn)行深度整合，建立起課程內(nèi)部以及課程之間的知識(shí)網(wǎng)絡(luò)，然后按圖索驥，找到對(duì)應(yīng)知識(shí)點(diǎn)深入學(xué)習(xí)，強(qiáng)化記憶。同時(shí)，使用思維導(dǎo)圖繪制實(shí)驗(yàn)記錄，方便教師了解學(xué)生對(duì)知識(shí)的掌握情況，并對(duì)接下來(lái)的教學(xué)進(jìn)行及時(shí)調(diào)整，實(shí)現(xiàn)教學(xué)相長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)完成后學(xué)生需撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告；同時(shí)，教師還會(huì)通過(guò)課前講解、課間提問(wèn)、問(wèn)卷調(diào)查等方式引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行討論，交流自己的實(shí)驗(yàn)體會(huì)和經(jīng)驗(yàn)，分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在的問(wèn)題，啟發(fā)學(xué)生思考解決問(wèn)題的對(duì)策，總結(jié)實(shí)驗(yàn)的得失，將所學(xué)儀器分析的知識(shí)點(diǎn)進(jìn)行梳理、歸納、總結(jié)，形成一個(gè)相互關(guān)聯(lián)的知識(shí)網(wǎng)絡(luò)。因此，實(shí)驗(yàn)報(bào)告中除包含對(duì)數(shù)據(jù)的處理和分析外，還包含學(xué)生的實(shí)驗(yàn)心得。

圖4 高分辨氣質(zhì)聯(lián)用法實(shí)驗(yàn)原理思維導(dǎo)圖

4 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是環(huán)境專業(yè)研究生培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。“高分辨氣質(zhì)聯(lián)用法分析環(huán)境樣品中的林丹”實(shí)驗(yàn)課共6 學(xué)時(shí)，3 學(xué)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)原理講解和環(huán)境樣品前處理實(shí)驗(yàn)，獲取目標(biāo)萃取物或洗脫物后將樣品進(jìn)行濃縮。3 學(xué)時(shí)進(jìn)行高分辨氣質(zhì)聯(lián)用儀的講解和操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由學(xué)生在課后進(jìn)行分析。該實(shí)驗(yàn)涉及樣品預(yù)處理技術(shù)、現(xiàn)代色譜及質(zhì)譜學(xué)、精確質(zhì)量計(jì)算、同位素分布和思維導(dǎo)圖繪制等，具有知識(shí)點(diǎn)多、綜合性強(qiáng)的特點(diǎn)，可全面提升學(xué)生的科研能力和實(shí)驗(yàn)操作能力。到目前，該實(shí)驗(yàn)課已開(kāi)設(shè)3 年，受到學(xué)生廣泛好評(píng)，實(shí)驗(yàn)效果較理想。