高分辨氣質(zhì)聯(lián)用法的實驗課程建設(shè)

王 慧，燕少瑋

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱 150090）

0 引言

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）由于具有靈敏度高、選擇性好、分離和鑒定同時進行等優(yōu)點，已經(jīng)逐步成為環(huán)境領(lǐng)域中非常重要的分析方法［1-5］。常規(guī)方法中通常用電子轟擊電離源（EI）結(jié)合單四級桿質(zhì)量分析器，這導(dǎo)致方法的分辨率較差，且目標(biāo)物的分子離子峰經(jīng)常在電離過程中丟失，為分析復(fù)雜基質(zhì)中的痕量目標(biāo)物帶來很大的難度。低能量電子轟擊電離源（LE-EI）結(jié)合高分辨氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-QTOF-MS）可以很好地解決上述問題，它不僅提高了方法的選擇性和靈敏度，而且可以降低假陽性結(jié)果的概率。此外，高分辨質(zhì)譜支持結(jié)構(gòu)測定，可以推斷未知物的化學(xué)元素和分子式。近年來，越來越多的研究生需要應(yīng)用高分辨質(zhì)譜完成他們的科學(xué)研究。

結(jié)合環(huán)境學(xué)科的特點和研究生科研項目的需求，2018 年我校環(huán)境學(xué)院在研究生綜合實驗課程中，開設(shè)了“高分辨氣質(zhì)聯(lián)用法分析環(huán)境樣品中的林丹”實驗。該實驗的開展響應(yīng)了學(xué)校提出的以大型精密儀器為教學(xué)平臺，結(jié)合經(jīng)典實驗樣品或?qū)W科前沿內(nèi)容，開展實驗教學(xué)的教改思路。本實驗以低能量電子轟擊離子源結(jié)合高分辨氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為核心內(nèi)容，通過實驗設(shè)計和條件優(yōu)化使學(xué)生了解高分辨氣質(zhì)聯(lián)用儀的工作原理，熟悉定性和定量等分析檢測技術(shù)，掌握環(huán)境樣品常用預(yù)處理方法的具體操作。

1 實驗教學(xué)方案

1.1 實驗內(nèi)容的選取

在儀器分析實驗教學(xué)中，選取合適的實驗內(nèi)容非常重要［6-9］。內(nèi)容的設(shè)計不僅要著眼于學(xué)生的知識與技能的培養(yǎng)，還要兼顧學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，重視學(xué)生的感受，使其能在實驗過程中充分展示主動性和創(chuàng)造性。

長期的教學(xué)實踐表明，與實際生活相關(guān)的實驗內(nèi)容及學(xué)科前沿內(nèi)容，往往更能引起學(xué)生的興趣，同時還能培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維能力和科研敏銳度。基于以上考慮，選取“環(huán)境樣品中的林丹”作為實驗對象。林丹作為典型的持久性有機污染物在媒體中常見報道，能極大地吸引學(xué)生的興趣［10］。同時，該物質(zhì)在環(huán)境科學(xué)研究中具有重要意義，是目前國內(nèi)外研究的熱點內(nèi)容［11-13］。

1.2 實驗基本原理

高分辨氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是指氣相色譜（GC）結(jié)合四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（QTOF-MS）技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了GC的高效分離能力和QTOF-MS的高靈敏度、高分辨率和極強的選擇性分離檢測技術(shù)。GC-QTOF-MS 樣品分析過程包括兩步：①待測樣品通過進樣口加熱氣化后進入GC，通過在流動相和固定相間反復(fù)交換，待測樣品中的不同成分由毛細(xì)管柱分離；②從GC 流出的被分離組分依次進入離子源被離子化，先在四級桿質(zhì)量分析器中根據(jù)質(zhì)荷比進行分離，再根據(jù)離子在飛行管中的飛行時間推算離子的精確質(zhì)量，具有相同質(zhì)荷比的離子會同時到達檢測器，檢測器將離子信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺瑐魉椭翑?shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

本實驗所用質(zhì)譜儀的離子源是低能量電子轟擊電離源，該離子源與化學(xué)電離源類似，為“軟”電離源，可以降低化合物在電離過程中發(fā)生分解的概率，通常僅丟失一個電子，產(chǎn)生M+準(zhǔn)分子離子，便于進行分子量確認(rèn)。多級質(zhì)譜分析則是以六級桿作為碰撞池，使準(zhǔn)分子離子與氮分子在碰撞池中發(fā)生碰撞，進而多級裂解獲得子離子碎片，實現(xiàn)對未知物的高質(zhì)量定性分析。

分析環(huán)境樣品中的痕量物質(zhì)最大的挑戰(zhàn)，即富集目標(biāo)物濃度使其大于儀器分析的檢出限，因此樣品的預(yù)處理過程是GC-QTOF-MS 分析的一個重要環(huán)節(jié)，樣品處理效果的好壞直接影響后續(xù)儀器測試所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。環(huán)境樣品的預(yù)處理方法很多，有液液萃取、固相萃取、固相微萃取法、快速溶劑萃取、微波輔助萃取和超聲輔助萃取等［14-16］。其中，固相萃取法（SPE）和快速溶劑萃取法（ASE）由于萃取效率高、有機溶劑使用量少、分離操作時間短等優(yōu)點在環(huán)境領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛。ASE是一種在較高壓力和較高溫度下，用常規(guī)溶劑對固體樣品進行萃取的前處理方法。增加溶劑的溫度能夠加速目標(biāo)物的萃取，壓力的增加能夠使溶劑的沸點也相應(yīng)地增加，從而使溶劑在萃取的過程中始終保持液態(tài)，進而在短時間內(nèi)實現(xiàn)對復(fù)雜基質(zhì)中痕量目標(biāo)物的高效萃取。SPE是一種基于吸附劑的萃取技術(shù)，其基本原理類似于液相色譜，吸附劑作為固定相，而液態(tài)樣品作為流動相。當(dāng)樣品通過萃取柱時，流動相中目標(biāo)物被保留在吸附劑上，雜質(zhì)和共萃取物通過淋洗等方法去除，隨后選擇合適的溶劑將目標(biāo)物洗脫下來，從而達到目標(biāo)物分離、凈化和濃縮的目的。

1.3 實驗儀器和材料

實驗儀器：美國安捷倫氣相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀、美國SUPELCO 固相萃取裝置、美國賽默飛ASE-350 快速溶劑萃取儀、德國默克密理博Milli-Q IQ 7000 超純水系統(tǒng)、精密電子天平。

實驗耗材和試劑：甲醇、正己烷、二氯甲烷均為色譜級、C18 固相萃取柱（Waters Oasis 6 mL，200 mg）。

1.4 實驗步驟

（1）環(huán)境樣品的制備。在農(nóng)場采集土壤樣品（50 g），加入適量的林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在土壤中的濃度為0.2 μg/g，隨后將加標(biāo)土壤混勻，通風(fēng)櫥中放置24 h，待溶劑完全揮發(fā)后進行實驗。

在松花江流域采集地表水（1 L），經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后加入適量的林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在環(huán)境水中的濃度為0.5 μg/L。

（2）土壤樣品快速溶劑萃取。稱取2 g樣品放入萃取罐，以正己烷作為萃取溶劑，溫度設(shè)置為80 ℃，預(yù)熱時間5 min，靜態(tài)萃取10 min，循環(huán)2 次，潤洗池體積60%，潤洗時間60 s。待萃取完成后。將上述所得的萃取液用氮吹儀濃縮至低于0.8 mL，加入正己烷定容至1 mL。所得的溶液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后用于GC-QTOF-MS分析。

（3）地表水樣品固相萃取。依次用4 mL 甲醇和5 mL超純水對固相萃取柱進行活化。將100 mL加標(biāo)水樣泵入活化后的固相萃取柱，通過活塞和真空泵控制流速為5 mL/min。再用超純水對固相萃取柱進行凈化以去除其他雜質(zhì)。在60 kPa壓力下，用氮氣干燥固相萃取柱3 min。將5 mL 甲醇泵入固相萃取柱，將C18吸附的目標(biāo)物洗脫下來，通過活塞和真空泵控制流速為1 滴/s。將上述所得的洗脫液用氮吹儀濃縮至低于0.2 mL，加入二氯甲烷定容至1 mL用于GC-QTOFMS分析。

（4）氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀運行條件。氣相色譜使用Agilent 7890B系統(tǒng)，色譜柱為Agilent HP-5M毛細(xì)管柱（φ0.25 mm×30 m，0.25 μm）；柱箱初始溫度120 ℃保持2 min，隨后以10 ℃/min的速度升溫至300 ℃。進樣口溫度250 ℃；不分流模式進樣；進樣體積1 μL；高純氦氣為載氣，流速為1.2 mL/min。

高分辨質(zhì)譜采用Agilent 7250 四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀，離子源為低能量電子轟擊離子源，能量15 eV；高純氮氣為碰撞氣，流速為1.5 mL/min；掃描方式為全掃描，掃描范圍50～500 amu。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 定性分析

首先分析林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液（250 μg/L），圖1（a）所示為林丹的高分辨質(zhì)譜總離子流圖（TIC）。林丹的高分辨質(zhì)譜圖如圖1（b）所示，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比m/z，縱坐標(biāo)為相對豐度，得到了m/z=180.937 0 和182.934 2這兩個特征離子峰，將特征離子輸入NIST17 譜庫進行比對，獲得目標(biāo)物分子結(jié)構(gòu)式。以質(zhì)譜峰的保留時間和特征離子碎片作為定性依據(jù)，對環(huán)境樣品中的目標(biāo)物進行定性分析，并引導(dǎo)學(xué)生使用NIST17 譜庫對樣品萃取液中的未知物進行定性。

選擇離子譜圖（EIC）可以有效降低復(fù)雜基質(zhì)對目標(biāo)物定性的干擾。如圖1（c）所示，與TIC 相比，EIC可以將目標(biāo)物的檢出限降低10 倍。在分析土壤樣品萃取液時，共萃取物較多，對林丹的分析造成了一定的干擾，學(xué)生應(yīng)用EIC 選擇性地考察感興趣的離子（180.937 2 和182.934 2），很好地解決了這一問題。

圖1 林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液分析結(jié)果

為激發(fā)學(xué)生興趣，可鼓勵學(xué)生優(yōu)化離子源電離能量值，并考察電子轟擊能量對方法靈敏度的影響。當(dāng)設(shè)置電離能量為15 eV時，得到的離子碎片較少，基峰峰高比電離能量為70 eV時要低。但在分析環(huán)境樣品中的痕量目標(biāo)物時，較低的電離能量能夠有效降低基線噪聲，提高方法的靈敏度。

2.2 定量分析

常用的定量方法包括外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。在實驗前的課堂提問中發(fā)現(xiàn)，約69%的同學(xué)僅了解內(nèi)標(biāo)法這一概念，從未具體應(yīng)用過。本實驗將外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法進行對比，加深學(xué)生對定量方法的理解，并掌握兩種方法的具體操作步驟。

（1）外標(biāo)法。用二氯甲烷對林丹儲備液進行逐級稀釋，獲得一系列濃度范圍為5～500 μg/L 的林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液。將配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液用GC-TOF-MS 進行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）內(nèi)標(biāo)法。以13C 六氯苯作為內(nèi)標(biāo)物。用二氯甲烷對林丹儲備液進行逐級稀釋，獲得一系列濃度范圍為5～500 μg/L的林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液。在不同濃度的林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液中，添加等量的內(nèi)標(biāo)物，使13C 六氯苯在一系列林丹標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度均為250 μg/L。將配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液用GC-TOF-MS進行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中林丹和13C六氯苯的濃度比值為橫坐標(biāo)，以林丹和13C六氯苯的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法獲得的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示。學(xué)生通過比較兩條曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）可知，在5～500 μg/L的濃度范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法的線性相關(guān)系數(shù)較高，因為它能校準(zhǔn)樣品基質(zhì)、進樣偏差和基線漂移等干擾因素引入的誤差。

圖2 外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比

方法的檢出限和定量下限分別由信噪比的3 倍信號和10 倍信號所對應(yīng)的濃度值得出。在土壤樣品萃取液和地表水樣品洗脫液中添加內(nèi)標(biāo)物，隨后用GCTOF-MS進行分析，將峰面積帶入內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，獲得林丹在環(huán)境樣品中的濃度值，并計算方法的精密度和準(zhǔn)確度。相關(guān)定性和定量分析結(jié)果見表1。

表1 定性和定量分析結(jié)果

2.3 “未知物”分子式的判定

在定性分析地表水萃取溶液時，基質(zhì)中有一個明顯的質(zhì)譜峰m/z=201.976 1（見圖3）。將該物質(zhì)作為共萃取的未知物，對其分子式進行推斷，具體步驟為：①學(xué)生在定性分析軟件“生成分子式”中輸入精確分子量，同時選擇失去一個電子模式，選擇可能包含的元素C，H，N，O，S，Cl，由軟件自動生成可能的分子式；②由于目標(biāo)物為不飽和結(jié)構(gòu)，碳的個數(shù)≤（2n +2）氫的個數(shù)，將誤差限制在7.5 ×10-6；③如果化合物含有的氮分子為奇數(shù)，那么化合物的分子量也為奇數(shù)，目標(biāo)物的分子量為201.976 7（電子質(zhì)量為0.000 55 u），可見其含有偶數(shù)個氮，學(xué)生可以排除含有奇數(shù)個氮分子的分子式；④X+1 同位素（13C）的相對強度可以用來估計分子中碳的數(shù)量，即13C 的相對強度（%）=1.1 ×碳的數(shù)量，m/z=202.978 5 相對于m/z=201.976 1 為5.7%，由此推斷碳的數(shù)量為5～6；⑤自然界中35Cl和37Cl存在比例為3∶1，因此如果目標(biāo)物的分子式中含有1 個氯，那么同位素X +2 的相對強度應(yīng)為33.3%，未知物同位素X+2 的相對強度為34.5%，這意味著含有1 個氯元素；⑥自然界中34S 相對32S 的豐度為4.6%，排除了分子式中含硫的可能性。

圖3 未知化合物基峰及其同位素質(zhì)譜峰的相對強度

經(jīng)過以上推斷，獲得最可能的分子式為C6H3ClN2O4。學(xué)生將其輸入化合物數(shù)據(jù)庫，獲得化合物名稱為“二硝基氯苯”，通過NIST 17 譜庫進行特征離子碎片比對，進一步證實該未知物為二硝基氯苯。

3 教學(xué)實踐要點

本實驗的難點在于實驗內(nèi)容多，注意事項多，影響因素多。而且大部分一年級的研究生在本科階段接觸大型儀器較少，同時對樣品預(yù)處理方法不熟悉，因此很難在短時間內(nèi)既能掌握儀器原理和操作，又能牢記分子式判定規(guī)則，同時完成實際樣品的快速分析。因此，在實驗教學(xué)中，鼓勵學(xué)生利用思維導(dǎo)圖構(gòu)筑課堂筆記和實驗記錄。學(xué)生可以在有效的時間內(nèi)將教師在課堂上所講的內(nèi)容完整地體現(xiàn)在思維導(dǎo)圖中，有助于其課后在大腦中還原課上所學(xué)內(nèi)容。利用思維導(dǎo)圖來幫助分析，可以提高學(xué)生對高分辨氣質(zhì)聯(lián)用分析的認(rèn)知能力（見圖4）。而且，思維導(dǎo)圖能夠?qū)⒀芯可C合實驗中多個單元的學(xué)習(xí)內(nèi)容進行深度整合，建立起課程內(nèi)部以及課程之間的知識網(wǎng)絡(luò)，然后按圖索驥，找到對應(yīng)知識點深入學(xué)習(xí)，強化記憶。同時，使用思維導(dǎo)圖繪制實驗記錄，方便教師了解學(xué)生對知識的掌握情況，并對接下來的教學(xué)進行及時調(diào)整，實現(xiàn)教學(xué)相長。

實驗完成后學(xué)生需撰寫實驗報告；同時，教師還會通過課前講解、課間提問、問卷調(diào)查等方式引導(dǎo)學(xué)生進行討論，交流自己的實驗體會和經(jīng)驗，分析實驗過程中存在的問題，啟發(fā)學(xué)生思考解決問題的對策，總結(jié)實驗的得失，將所學(xué)儀器分析的知識點進行梳理、歸納、總結(jié)，形成一個相互關(guān)聯(lián)的知識網(wǎng)絡(luò)。因此，實驗報告中除包含對數(shù)據(jù)的處理和分析外，還包含學(xué)生的實驗心得。

圖4 高分辨氣質(zhì)聯(lián)用法實驗原理思維導(dǎo)圖

4 結(jié)語

實驗教學(xué)是環(huán)境專業(yè)研究生培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。“高分辨氣質(zhì)聯(lián)用法分析環(huán)境樣品中的林丹”實驗課共6 學(xué)時，3 學(xué)時進行實驗原理講解和環(huán)境樣品前處理實驗，獲取目標(biāo)萃取物或洗脫物后將樣品進行濃縮。3 學(xué)時進行高分辨氣質(zhì)聯(lián)用儀的講解和操作，實驗結(jié)果由學(xué)生在課后進行分析。該實驗涉及樣品預(yù)處理技術(shù)、現(xiàn)代色譜及質(zhì)譜學(xué)、精確質(zhì)量計算、同位素分布和思維導(dǎo)圖繪制等，具有知識點多、綜合性強的特點，可全面提升學(xué)生的科研能力和實驗操作能力。到目前，該實驗課已開設(shè)3 年，受到學(xué)生廣泛好評，實驗效果較理想。