采用連續監測法建立鄭州地區健康成年人血清脂蛋白相關磷脂酶A2活性參考區間

毋小玉，崔發財，鄭培明，劉艷紅，李剛

（河南省人民醫院檢驗科，河南 鄭州450003）

脂蛋白相關磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2）屬于磷脂酶超家族成員之一,由單核-巨噬細胞和T淋巴細胞分泌，通過與高密度脂蛋白或低密度脂蛋白顆粒相結合的形式釋放進入循環系統[1]。研究發現，Lp-PLA2可發揮其酶活性水解動脈壁內形成的氧化型低密度脂蛋白,生成溶血卵磷脂和氧化型游離脂肪酸兩種炎癥介質,后二者刺激細胞因子和粘附因子的表達并促進內皮細胞功能障礙、內皮細胞死亡及斑塊內壞死核形成等多種動脈粥樣化效應[2]。血清Lp-PLA2活性升高與血管內壁炎癥反應和氧化應激相關,后二者是促進斑塊進展和不穩定性并導致心腦血管事件發生的重要因素,因此監測Lp-PLA2活性水平變化有助于臨床了解患者心腦血管疾病的發病風險,以便及時采取有效的干預措施[3,4]。此外,在糖尿病腎病[5]、糖尿病視網膜病變[6]、膽結石伴膽囊炎[7]及多發性硬化癥[8]等以炎癥病變為基礎的疾病中也發現血清Lp-PLA2活性升高并成為這些疾病發生的風險因素。我國目前已取得注冊資格并用于Lp-PLA2活性檢測的試劑廠家不多,但參考范圍存在差異,這給臨床預估心腦血管疾病風險造成一定困擾。本研究參考美國臨床實驗室標準化協會(clinical and laboratory standards institute,CLSI)C28-A3文件及我國衛生行業標準WS/T 402-2012《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》文件的相關要求，采用連續監測法檢測鄭州地區體檢健康成年人血清Lp-PLA2酶活性值，并初步確立適合本實驗室的參考區間。

1 材料和方法

1.1 研究對象 隨機選取2020年3月至5月在河南省人民醫院特需中心體檢健康者600名,其中男性300名,女性300名，年齡18~76歲。研究對象按照年齡進行分組，分別為18~29歲118例，男性42例、女性76例；30~39歲132例，男性66例、女性66例；40~49歲120例,男性62例、女性58例；50~59歲116例，男性66例、女性50例；60歲以上組114例，男性64例、女性50例。

1.2 納入標準 研究對象的納入標準為：血壓正常,18.5<體脂指數（BMI）<23.9，肝腎功能指標正常，心肌損傷標志物指標正常，血清膽固醇<5.17mmol/L（200mg/dl），血清甘油三酯<1.7mmol/L（150mg/dl），血清低密度脂蛋白膽固醇<3.1mmol/L（200mg/dl），血清腫瘤標志物指標正常，傳染病相關抗原、抗體檢測結果正常，血常規、尿常規正常，胸部X線攝影或胸部CT、心電圖及B超檢查均無異常表現。無糖尿病史，未患有心腦血管疾病、無重要臟器功能障礙、未患有腫瘤疾病、無家族遺傳病史，無慢性病史，近期未服用降血脂或降血壓藥物。

1.3 儀器及主要試劑SIEMENS ADVIA2400全自動生化分析儀（德國西門子公司），血清Lp-PLA2活性檢測試劑盒（連續監測法），血清Lp-PLA2校準品和質控品（寧波美康生物科技股份有限公司）。

1.4 標本采集及檢測 采集禁食（≥8h）受試者早上6點至8點時間段的靜脈血3 ml，30 min內離心（3500r/min，5min）并分離血清,保存于-80℃超低溫冰箱。樣本檢測前應首先采用血清Lp-PLA2活性試劑盒配套的校準品進行項目校準,并進行Lp-PLA2質控品檢測,質控結果在控后方可開展樣本檢測工作。檢測原理：血液樣本中的Lp-PLA2水解特異性底物1-豆蔻酰基-2-（4-硝基苯基琥珀酰基）-sn-丙三基-3-磷酸膽堿的sn位點,生成4硝基苯基琥珀酸,其在水溶液中降解后生成的對硝基酚可在生化分析儀光學系統進行檢測,通過特定波長下吸光度的變化計算出脂蛋白相關磷脂酶A2的活性。

1.5 統計學分析 采用狄克遜（Dixon）檢驗法剔除原始數據中的離群值，有效數據采用SPSS17.0統計學軟件進行分析，采用K-S檢驗判斷各組數據是否呈正態分布，計量資料采用±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。分別計算Z值和Z*值并進行比較,確定血清脂蛋白相關磷脂酶A2活性參考區間是否需要按性別分組。采用百分位數法計算95%參考區間。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正態性檢驗 將所有檢測數據從小到大排列后計算全距（R）為702.4，兩個相鄰最大值間差值與兩個相鄰最小值間差值的絕對值分別為164.6和5.8，均小于臨界值，表明600個觀測值均為有效數據。K-S檢驗結果顯示，健康成年人血清Lp-PLA2活性水平服從正態分布（Z=0.725，P=0.669）；不同性別間血清Lp-PLA2活性水平服從正態分布（男性：Z=0.749，P=0.629；女性：Z=0.582，P=0.887）；不同年齡段間血清Lp-PLA2活性水平服從正態分布（18~29歲：Z=0.690,P=0.727；30~39歲：Z=0.675，P=0.753；40~49歲：Z=0.763，P=0.605；50~59歲：Z=0.431，P=0.992；大于60歲：Z=0.474，P=0.978）。

2.2 血清Lp-PLA2活性水平組間比較 男性血清Lp-PLA2活性值為407±109U/L，顯著高于女性（343±87U/L，t=5.661，P<0.01），見表1。Z檢驗結果顯示Z=5.66>Z*=3.33，需單獨建立男女性健康成年人血清Lp-PLA2活性參考區間。單因素方差分析結果顯示,男性各年齡組間酶活性水平無顯著差異（F=1.286，P=0.278），女性各年齡組間酶活性水平有顯著差異（F=2.480，P=0.047）。LSD檢驗進一步分析顯示18~29歲年齡組與30~39歲年齡組間酶活性水平無顯著差異（P>0.05），40歲以上3個年齡組間酶活性水平無顯著差異（P>0.05），而40歲以下兩個年齡組分別與40歲以上三個年齡組之間酶活性水平差異顯著（均P<0.01）。將女性合并為<40歲組和≥40歲組后，女性<40歲組血清Lp-PLA2活性水平顯著低于≥40歲組(317±79U/L vs 361±88U/L，t=3.145，P<0.01)，見表2。

表1 不同性別組間健康成年人血清Lp-PLA2活性比較（±s）

表1 不同性別組間健康成年人血清Lp-PLA2活性比較（±s）

注：與男性組比較，**P<0.01

性別 例數男女合計300 300 600年齡（歲） Lp-PLA2(U/L)45（18~75）42（18~76）44（18~76）407±109 343±87**375±103

2.3 血清Lp-PLA2活性參考區間的建立 以百分位數法（P2.5~P97.5）建立健康成年人血清Lp-PLA2活性參考區間,男性為189~629U/L,女性為160~479U/L（18~39歲）,165~515U/L（40~76歲）,見表3。

3 討論

心腦血管疾病（cardiovascular and cerebrovascular diseases，CCVDs）目前仍是導致我國人群死亡的首要病因，近年來隨著生活壓力增加、飲食習慣改變、環境污染等因素的影響，該疾病的患病率和死亡率呈逐年增加趨勢[9,10]。研究表明動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要致病機制，而炎癥反應在動脈粥樣硬化形成過程中起著本質作用[11]。Lp-PLA2是一種新型的血管特異性炎癥反應標志物，其參與了動脈粥樣斑塊形成的發生、發展、不穩定性及破裂的各個階段，相較于傳統的炎癥標志物C-反應蛋白、腫瘤壞死因子和白細胞介素等，Lp-PLA2具有早期識別、高特異性和檢測簡便的特點[12]，我國于2015年頒布了《脂蛋白相關憐脂酶A2臨床應用中國專家建議》推薦將Lp-PLA2檢測用于冠心病及缺血性腦卒中的危險預測[13]。此外，在急性腦出血、缺血性中風、急性冠狀動脈綜合征等心腦血管疾病的預后研究中也發現Lp-PLA2活性升高的患者術后死亡和再住院風險增加,是判斷預后是否良好的重要生物標志物[14,15]。

表2 不同年齡組間健康成年人血清Lp-PLA2活性比較（±s）

表2 不同年齡組間健康成年人血清Lp-PLA2活性比較（±s）

注：與女性組18~29歲比較，*P<0.05；與女性組30~39歲比較，#P<0.05；與女性組18~39歲比較，**P<0.01

性別 年齡（歲）男女18~29 30~39 40~49 50~59>60 18~29 30~39 40~49 50~59>60 18~39 40~76例數 Lp-PLA2(U/L)42 66 62 66 64 76 66 58 50 50 126 174 397±115 432±102 377±110 401±104 423±113 315±68 322±94 357±108*#364±85*#363±71*#317±79 361±88**

表3 百分位數法建立血清Lp-PLA2活性參考區間

表4 健康成年人血清Lp-PLA2活性參考區間的地區差異

建立待測指標的參考區間是正確解釋檢驗結果、提供臨床診斷或輔助診斷價值及反饋治療效果的前提。由于納入研究的生物個體間存在性別、年齡、種族、居住地、生活習慣等因素的差異，采用同一檢測原理的不同試劑生產廠家所提供的參考范圍存在差異,我國合格評定認可委員會（C-NAS）認可指南中明確建議各醫學檢驗機構應建立適合本地區特征的項目參考范圍。本研究中我們使用寧波美康公司生產的脂蛋白磷脂酶A2檢測試劑盒結合西門子全自動生化分析儀構成的分析系統,采用連續檢測法隨機檢測鄭州地區600例健康成年人血清Lp-PLA2酶活性水平及其在不同性別及年齡組間的表達差異,并初步建立了適合本地區的人群的生物參考區間。

我們的研究結果顯示,男性健康成年人血清Lp-PLA2活性水平顯著高于女性,并且在女性不同年齡段中存在差異表達，高年齡人群中該酶表達活性有升高趨勢，這與Donato LJ等[16]人的研究結果相一致。《中國心血管病報告2018》[17]指出，男性心腦血管疾病發病率遠高于女性,且在心腦血管疾病的發病危險因素如肥胖、高血壓、血脂異常、糖尿病等疾病中也呈現出男性發病率高于女性的趨勢,而血清Lp-PLA2活性的性別間差異可能與男性心腦血管疾病發病率高有關。我國目前已建立血清Lp-PLA2活性參考區間的地區有上海[18]、長沙[19]和杭州[20]，三個地區研究結果均指出血清Lp-PLA2活性存在性別差異和女性年齡亞組間差異,這與我們的研究結果相一致。不同之處在于，鄭州地區表觀健康人群的血清Lp-PLA2活性整體偏低，此外，在女性參考區間年齡截點上，我們的研究結果與長沙地區相同，不同于上海和杭州地區,見表4。鄭州地區屬于我國北方城市，與其他三個地區存在明顯的氣候環境與飲食結構差異，這可能是血清Lp-PLA2活性與其他地區存在差異的主要原因,另外使用不同廠家提供的血清Lp-PLA2活性檢測試劑盒和納入調查研究的樣本量少也是造成研究結果存在差異性的可能性因素。

綜上所述,本研究調查了鄭州地區健康成年人血清Lp-PLA2活性,初步建立了適合本地區人群的血清Lp-PLA2活性參考區間,有助于臨床判斷血清Lp-PLA2活性動態變化是否具有臨床意義，以便及時采取有效的干預手段來降低心腦血管疾病的發生率和死亡率。