多重PCR快速檢測化妝品中三種致病菌的研究

楊秀茳，　郭曉苑，　文　霞，　謝小保

廣東省微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室 廣東 廣州 510070

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多重PCR快速檢測化妝品中三種致病菌的研究

楊秀茳，郭曉苑，文霞，謝小保*

廣東省微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室 廣東 廣州 510070

利用多重PCR技術建立快速檢測化妝品中三種致病菌的方法。根據已報道的大腸桿菌phoA基因、銅綠假單胞菌外膜蛋白基因oprL和金黃色葡萄球菌特異性序列SmaI選擇特異性引物，對人工染菌化妝品進行多重PCR檢測。結果顯示，三種致病菌的基因組DNA均可與各自引物特異性結合，擴增產物大小分別為622 bp、504 bp和426 bp。該方法用于人工污染的化妝品中，大腸桿菌的檢出限濃度為103CFU/mL，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢出限濃度為105CFU/mL。作者建立的多重PCR方法可同時快速、特異地對化妝品中三種致病菌進行檢測，在化妝品行業具有較大的應用價值。

多重PCR； 化妝品； 致病菌； 檢測

近幾年我國化妝品消費量不斷上升，其安全問題一直備受關注，其中微生物指標是化妝品衛生質量合格與否的重要影響因素。目前我國對進出口化妝品規定一律按《化妝品衛生規范》(2007版)進行檢驗，其中明確規定了每克或每毫升化妝品產品中不得檢出糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，對此也列出了詳細的檢驗方法，但是該方法需要配制各種培養基和試劑，操作繁瑣，耗時4 d～7 d，且存在對一些致病性金黃色葡萄球菌、糞大腸菌群檢出率很低的問題[1]。

為了適應我國化妝品行業的發展，急需建立化妝品微生物快速檢測方法。多重PCR(multiplex-PCR)是在常規PCR基礎上建立起來的一種新型檢測技術，是在同一反應體系中同時加入多對特異性引物擴增出多條目的DNA片段的PCR反應，可用于多種病原微生物的同時快速檢測或鑒定[2-4]。該技術以快速、經濟、高效的優勢已被用于食品或環境中同時檢測多種病原微生物[5-11]。近幾年，PCR技術在化妝品檢測行業也得到了應用，但還停留在對單個菌株的檢測[12-13]，而同時檢測化妝品中大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的方法還未有相關報道。本文對化妝品中大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測做了初步研究，以期建立一種快速、準確的化妝品微生物檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器Centrifuge5424小型高速離心機(Eppendorf)、紫外分光光度計(METASH UV-5200PC)、 Mastercycler?nexus GSX1梯度PCR儀(Eppendorf)、凝膠成像分析系統(Bio-Rad)。

1.1.2主要試劑2xEasyTaq?PCR SuperMix、Trans2K?PlusDNA Maker、Agarose(北京全式金生物技術有限公司)，細菌DNA提取試劑盒(HiPure Bacterial DNA Kit，Magen)，營養瓊脂(NA)培養基(廣州環凱微生物科技有限公司)。

1.1.3引物合成

根據大腸桿菌的持家基因phoA、銅綠假單胞菌的外膜蛋白基因oprL和金黃色葡萄球菌的特異性序列SmaI，利用Primer5.0分析篩選文獻引物，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，其序列及擴增長度見表1。

表1　目的基因名稱及引物序列

1.1.4菌株

標準菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC8739、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC6538、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027，均購自廣東省菌種保藏中心，由本實驗室保存。

污染菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)，嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)，惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，由本實驗室從污染化妝品中分離。

1.1.5樣品

某化妝品公司送檢的化妝水和保濕乳，分別編號為H和B，采用傳統方法檢測無微生物污染。

1.2方法

1.2.1菌液制備

分別挑取3支標準菌株和6支污染菌株培養基上的單菌落接種于NA平板上，37 ℃培養18 h。分別制備9株菌的菌懸液和3株標準菌的混合菌懸液，濃度為108CFU/mL，然后將混合菌液稀釋至102CFU/mL，即制備成了濃度分別為108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL和102CFU/mL的菌懸液。

1.2.2模板DNA制備

首先分別吸取9種菌懸液和3種標準菌的混合菌懸液各1 mL于1.5 mL離心管中，離心去上清，收集菌體，采用試劑盒提取基因組DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.3PCR特異性分析

分別以3個標準菌株、3個混合標準菌株和6個污染菌株的DNA為模板，用3對引物進行PCR擴增，反應體系(28 μL)：2xEasyTaq?PCR SuperMix 14 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O補足至28 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，進行30個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4人工污染樣品

取3組15mL離心管，每組7支，第一組加生理鹽水，9 mL/支，編號7、6、5、4、3、2、1；第二組化妝水9g/支，編號B7、B6、B5、B4、B3、B2、B1；第三組保濕乳9g/支，編號H7、H6、H5、H4、H3、H2、H1。

每組離心管依次加入1 mL 108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL和102CFU/mL的混合菌液，充分混勻，即制備成107CFU/mL、106CFU/mL 、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL和101CFU/mL的生理鹽水對照樣品組和B、H實驗樣品組。離心去上清，對照組菌體沉淀直接提取DNA，實驗組用生理鹽水將菌體沉淀重復洗滌3次后提取細菌DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.5多重PCR測定靈敏度

以人工污染樣品中的混合DNA為模板，同時用3對引物進行多重PCR擴增。通過對多重PCR反應體系參數進行優化，確定了最佳反應體系(28μL)：2xEasyTaq?PCR SuperMix 14 μL，3對上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板1 μL/2 μL，ddH2O補足至28 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，進行35個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.6PCR產物電泳檢測

以Trans2K?PlusDNA Maker作相對分子質量指示，取PCR擴增產物5 μL用1%瓊脂糖凝膠(含染色劑Gold view)在120 V電壓下電泳30 min，然后置于凝膠成像分析系統中觀察結果并拍照。

2　結果與討論

2.1結果

2.1.1多重PCR擴增結果及特異性分析

根據所篩選的3對特異性引物對3個標準菌株、3個混合標準菌株和6個污染菌株的基因組DNA進行PCR擴增，檢測3對引物的特異性，結果顯示3對引物均能與對應的菌株發生特異性結合，出現了與預期擴增長度相一致的清晰條帶，6株其他菌株均未擴增出條帶，結果見圖1和表2。

M：Trans2K?PlusDNA Maker；1：EscherichiacoliATCC8739；2：PseudomonasaeruginosaATCC9027；3：StaphylococcusaureusATCC6538；4：三株標準菌混合；5：Bacillussubtilis；6：Staphylococcussaprophyticus；7：Klebsiellapneumonia；8：Stenotrophomonasmaltophilia；9：Burkholderiacepacia；10：Pseudomonasputida

圖1　多重PCR擴增特異性

“+”：表示PCR擴增陽性；“-”：表示PCR擴增陰性

2.1.2人工污染樣品的多重PCR擴增靈敏度

用不同濃度的混合標準菌液污染化妝水和保濕乳兩個樣品，比較兩者可檢出的菌液濃度，同時以相應濃度的生理鹽水菌液為對照，檢測多重PCR靈敏度。

不同濃度的生理鹽水混合菌液提取DNA后進行多重PCR擴增，污染菌液濃度為105～107CFU/mL時，3種菌株均擴增出目的條帶，污染菌液濃度為104CFU/mL時，只有大腸桿菌擴增出了清晰條帶，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌擴增出了較淡的條帶，可辨度低，菌液濃度在101～103CFU/mL時，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌已無目的條帶出現，只有大腸桿菌在103CFU/mL濃度處擴增出較淡條帶。可見，在生理鹽水對照樣中，大腸桿菌的可檢出菌液濃度最低限度為103CFU/mL，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的可檢出菌液濃度最低限度為104CFU/mL，結果見圖2。

兩個人工污染的化妝品樣品之間，以及兩者與生理鹽水菌液之間比較，檢出效果差異不大，可檢出的條帶在長度上相一致，表明經過3次洗滌后，化妝品成分并未對基因組DNA提取產生影響。在污染濃度為105～107CFU/mL時，兩者都能清晰檢出3株菌的條帶，在污染濃度為101～104CFU/mL時，兩者均未檢出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的條帶，只有大腸桿菌在104CFU/mL和103CFU/mL濃度處出現了較淡的條帶。可見，兩個污染化妝品樣品中，采用多重PCR技術可檢出103CFU/mL以上濃度的大腸桿菌以及105CFU/mL以上濃度的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，結果見圖2。

2.2討論

作者多年的檢測工作中，經常在化妝品中檢出銅綠假單胞菌，檢出量大，甚至是批量污染。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌雖檢出相對較少，但也有檢出，尤其是在天氣潮濕的季節，送檢量和檢出率明顯加大。這3種菌株均為常見的致病菌，大腸桿菌在免疫力低下的人體中容易引起感染，金黃色葡萄球菌在敏感型群體內可引起呼吸道疾病[11，14]。銅綠假單胞菌附著在人身上可引起人皮膚化膿性感染[15]。化妝品中存在其中任何一種菌都對人體健康存在威脅，因此，研究這三種致病菌株的快速檢測方法是必要的。

本研究在查閱并分析了相關文獻后篩選了3對目標基因的特異性引物，其中大腸桿菌phoA基因是其持家基因[16]，許一平等[17]采用一對引物同時擴增3種菌的基因組DNA的方法驗證了其特異性。金黃色葡萄球菌的SmaI基因被證實為其特異性序列，徐曉可等[18]采用10株金黃色葡萄球菌、46株非金黃色葡萄球菌以及對43份食品樣品的檢測驗證了該基因具有很好的特異性。oprL是銅綠假單胞菌特有的外膜蛋白基因，張淑紅等[19]通過比較檢測人工污染樣品的傳統培養法和分子生物學方法以及對自然界中的8個水體樣品的檢測驗證了該基因的特異性。

M：Trans2K?PlusDNA Maker；1～7：生理鹽水對照樣品，編號1、2、3、4、5、6、7，即混合菌濃度依次為101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL和107CFU/mL；8～14：化妝水B樣品，編號B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7，即人工加菌終濃度依次為101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL和107CFU/mL；15～21：保濕乳H樣品，編號H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7，即人工加菌終濃度依次為101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL和107CFU/mL。

圖2人工污染樣品的多重PCR擴增靈敏度

本研究根據3對引物的Tm值確定各自的退火溫度，首先建立了單重PCR的反應條件，擴增出片段長度分別為622 bp、426 bp和504 pb的3個保守序列，驗證了3對目標基因引物的特異性。同時在單重PCR的基礎上，調整和優化了多重PCR的引物濃度和退火溫度，進行了多次預實驗，最終確定了反應體系和條件。建立的多重PCR反應體系不存在引物錯配、交叉擴增，也沒有引物二聚體的產生，具有很好的特異性，可以有效地在化妝品中同時檢測大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，整個過程只需1 d，可檢出的菌量分別為大腸桿菌103CFU/mL、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌105CFU/mL。

但是與傳統方法相比，本實驗建立的多重PCR檢測靈敏度偏低，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度低于大腸桿菌，原因可能是提取混合菌液基因組DNA時濃度存在差異，也可能是反應體系中引物濃度的配比還沒達到最佳，作者將在后續的實驗中繼續進行研究。在實際樣品的檢測中，通過預先進行增菌的方式提高多重PCR檢測的靈敏度。

3　結論

化妝品微生物污染不僅給企業帶來經濟損失，更嚴重危害人體健康，因此快速有效的化妝品微生物檢測至關重要，本研究建立的多重PCR檢測方法可同時、快速、準確檢測化妝中的大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，為化妝品行業的快速檢測技術提供了基礎，在化妝品行業具有較大的應用價值。

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Rapid detection of three types of bacterial pathogens in cosmetics by multiplex PCR

YANG Xiu-jiang, GUO Xiao-yuan, WEN Xia, XIE Xiao-bao

Guangdong Institute of Microbiology, Guangdong Detection Center of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou, Guangdong 510070, China

A multiplex PCR (m-PCR) method for rapid detection of three types of bacterial pathogens in cosmetics was developed. According to the reported, three pairs of primers were chosen for the m-PCR detection of artificially contaminated cosmetics, based on thephoA gene ofEscherichiacoli, the outer membrane protein (OMP)oprL gene ofPseudomonasaeruginosaand theSmaI specific sequence ofStaphylococusaureus. The results indicated the three pairs of primers bound specifically to the genomic DNA of the three types of bacterial pathogens and amplified three fragments of 622 bp forEscherichiacoli, 504 bp forPseudomonasaeruginosaand 426 bp forStaphylococcusaureus. In the case of artificially contaminated cosmetics, the detection limits of 103CFU/mL forEscherichiacoliwere achieved, and the detection limits of 105CFU/mL forPseudomonasaeruginosawere achieved as well asStaphylococusaureus. This m-PCR method could provide a simultaneous, rapid and specific detection for three types of bacterial pathogens in cosmetics, and have greater practical application values.

multiplex PCR; cosmetics; bacterial pathogens; detection

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.011

廣東省科技計劃項目(2014A040401054)，揭陽市產學研結合項目(0201)。

楊秀茳(1987～)，女，助理工程師。E-mail：xiujiangjiang99@163.com。

謝小保(1966～)，男，研究員。E-mail：xiaobaoxie@126.com。