DNA微陣列芯片技術檢測培陽肺結核患者痰樣本中結核分枝桿菌耐藥性的價值

王 悅，孫 穎，孫炳奇

結核病(TB)位居全球單一致死性傳染病的首位(排在HIV/AIDS之前)，每年約有50萬利福平耐藥病例，其中78%為耐多藥結核病(MDR-TB)。我國是全球耐藥結核病負擔最大的3個國家之一。異煙肼(INH)和利福平(RIF)的廣泛使用及菌體基因突變加劇了耐藥性的發生[1-3]。實際工作中，由于傳統的藥敏試驗方法費時、繁瑣，無法滿足快速臨床診斷的要求[4-5]。目前，許多快捷高效的分子技術已成功應用于MTB檢測，包括實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、線性探針耐藥檢測分析(LPAs)和寡核苷酸或DNA微陣列等。

DNA微陣列技術(基因芯片耐藥基因檢測技術)是指在rpoB、inhA和katG基因的特定位置結合特異性核苷酸，檢測痰標本中MTB對于利福平和異煙肼的耐藥情況。

本研究以MGIT 960藥敏試驗為參考標準，驗證芯片法對MDR-TB的檢測能力。對于芯片法與液體藥敏檢測不一致的結果，采用WHO推薦的線性探針耐藥檢測法進行復核，以期客觀的探討芯片法對培陽結核病患者的耐藥性的檢測能力。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1研究對象 收集沈陽市第十人民醫院2019年7至12月間，389名疑似肺結核患者的合格痰樣，排除標準為治療超過兩周的患者。年齡分布為2～90歲，男性入組280人(72.0%)，女性入組109人(28.0%)。本課題已通過沈陽市第十人民醫院倫理委員會批準。

1.1.2主要儀器及試劑 晶芯○R微陣列芯片掃描儀LuxScanTM10K-B，Extractor 36 核酸快速提取儀，HybSet基因微陣列芯片雜交盒，結核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒，北京博奧晶典生物集團有限公司；MGIT960全自動結核分枝桿菌快速培養法儀及配套試劑，美國BD公司；全自動核酸印記微生物檢測系統(GT-Blot48)及配套試劑，法國生物梅里埃。

1.2主要方法及工作流程 見圖1。

1.2.1痰標本前處理 流程按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[6]規定進行，培養法后剩余痰處理液留作芯片法檢測及備用。

1.2.2培養法 按照BACTEC MGIT960系統操作說明書進行操作。儀器報陽后對培養物進行抗酸染色鏡檢確認，鏡下抗酸桿菌扭曲纏繞呈紅色繩索狀，而其他細菌和細胞呈藍色。確認為抗酸桿菌后進行MPB64抗原檢測，陽性者進入培養法藥敏試驗(培養管中的藥物終濃度為利福平1.0 μg/mL,異煙肼0.1 μg/mL)。

1.2.3芯片法 對于培養陽性標本，取出留存的痰處理液，進行芯片法耐藥檢測。檢測耐藥位點包括利福平耐藥相關基因rpoB基因檢測6個位點，即531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位 CAA→AAA、516位 GAC→GTC、516位 GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG等13種突變型，對于異煙肼耐藥相關基因katG基因及inhA基因啟動子各檢測1個位點，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2個突變型，inhA基因啟動子-15位C→T突變型。按照北京博奧生物集團有限公司的試劑盒說明書進行DNA提取，PCR擴增，芯片雜交及結果判讀過程，對于“無法判定”的結果及時進行復檢，以確定是否有可用的耐藥結果。

1.2.4線性探針耐藥檢測法 原理基于PCR擴增產物通過反向雜交技術與預先固化在試紙條上的特異性探針雜交，通過條帶顯色情況判定耐藥性。檢測耐藥基因為rpoB是利福平耐藥、katG是異煙肼高水平耐藥和inhA是異煙肼低水平耐藥，在雜交帶上3個基因的野生型和突變型均可以體現。標本處理按照法國生物梅里埃有限公司的試劑盒說明書進行，包括DNA提取、擴增、雜交、制備流程。判讀標準為野生條帶(利福平8個野生探針，異煙肼katG和inhA野生探針分別為1個和2個)均顯色且突變條帶無顯色時為敏感，野生條帶有缺失或突變條帶顯色為耐藥。

圖1 主要方法及工作流程圖

1.2.5統計學處理 所有檢測結果、患者基本信息采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析。以MGIT 960藥敏試驗結果為參考標準，計算芯片法耐藥檢測的靈敏度、特異度、一致性、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)和Kappa值以及2種方法對于檢測MDR-TB結果的比對，并對結果不一致者進行統計說明。

相關公式解釋：靈敏度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；一致性=(真陽性例數+真陰性例數)/(真陽性例數+假陽性例數+真陰性例數+假陰性例數)×100%；Kappa值≥0.75兩者一致性較好；0.4≤Kappa<0.75兩者一致性一般；Kappa<0.4兩者一致性較差。

2 結 果

2.1培養法結果 對389例疑似肺結核患者的痰樣本進行培養，334例為培養陽性，其中40～60歲年齡段的患者的陽性率最高90.2%(157例)；男性患者陽性檢出率88.6%(248例)高于女性78.9%(86例)；初治患者陽性檢出率86.9%(232例)高于復治患者為83.6%(102例)，見表1。

2.2藥敏結果 334例培陽標本中，2例為MPB64抗原檢測陰性，所以有332例進行了MGIT 960藥敏試驗；同時挑出培陽患者的痰處理液，用芯片法檢出共323例有藥敏結果，此外檢出非結核分枝桿菌2例，這與MPB64的陰性檢測結果相符，另有9例無結果(未檢出MTB)，這可能是分子法檢出限的劣勢所致。與參考標準對比，芯片法檢測RIF和INH的Kappa值均大于0.75，顯示了較好的一致性；芯片法除了異煙肼的靈敏度稍低(82.6%)外，其他方面的參數均較好，見表2。這個結論和大多數文獻報道的基本一致。

表1 389例患者特征和培養法對抗酸桿菌陽性的檢出情況

表2 芯片法檢測利福平和異煙肼耐藥與培養法藥敏結果的比較

2.3芯片法檢測MDR-TB的能力評價 根據治療史的不同，我們將患者分為初治和復治。與參考標準對比，芯片法檢測MDR-TB 的靈敏度、特異度、一致性和Kappa值見表3。在MDR-TB的病人中，應用芯片法檢測的Kappa值可以達到0.86，與液體法藥敏試驗有較好的一致性；并且在初治患者中Kappa值為0.95，靈敏度為95.5%，明顯優于復治患者，這對于更早的指導臨床參考用藥有著非常重要的意義。

表3 芯片法對不同治療史樣本患者MDR-TB結果的判定

2.4不一致的耐藥結果 本研究中“不一致”的含義為芯片法對利福平和異煙肼相關耐藥基因檢測結果與MGIT 960藥敏結果不符。總體上看，利福平耐藥結果不符者有11例(表4)，其中線性探針法有7例與MGIT 960藥敏法一致，4例與芯片法一致；在異煙肼耐藥結果的17例(表5)不一致中,線性探針法有9例與參考標準一致，有8例與芯片法一致。

表4 3種檢測方法對利福平耐藥不一致結果的對比分析

表5 3種檢測方法對異煙肼耐藥不一致結果的對比分析

3 討 論

本研究顯示，芯片法比培養法藥敏試驗更快速并且具有較好的準確性[7]，與參考標準比較，對MTB耐藥檢測及MDR-TB檢測的靈敏度、特異度、符合率、PPV、NPV和Kappa值與相關報道的結果相似，即芯片法靈敏度中等，但是特異度較高[8-10]。

分類A中，有5例利福平和14例異煙肼耐藥結果為芯片法敏感而MGIT 960藥敏法耐藥。其原因可能是分子法的檢測限一般在20%左右，而表型法的檢測限可達到1%[11]；分子法檢測的耐藥突變位點有限，不能覆蓋所有耐藥突變的位點；除了位點突變還存在其他耐藥機制，如外排泵[12-13]，這也是分子檢測不能及的。上述情況也可能是導致芯片法在檢測9例培陽痰液時出現未檢出MTB的原因。在A分類中，線性探針共有12例與MGIT 960藥敏法一致，可能是由于耐藥檢測范圍大于芯片法所致，如芯片法僅檢測了rpoB基因核心突變區的6個位點的13種突變類型，而線性探針技術則通過8條分子探針覆蓋了rpoB基因核心突變區的全部27個氨基酸的81個堿基[14]；線性探針含有katG315(AGC→ACA)、inhA-16(T→G)、inhA-8(T→C)和inhA-8(T→A)突變類型，而芯片只在katG和inhA基因啟動子各測一個位點[15-16]。但是我們是對不一致的樣本進行線性探針的檢測，所以不能以與參考標準一致結果數量多而斷定線性探針法的檢測結果更接近于參考標準；其次芯片法的自動判讀更大程度的避免的人工判讀的誤差的產生；此外芯片法的封閉式雜交流程更大程度的避免了非特異片段的干擾和交叉污染的產生，降低了假陽性的出現。

分類B中，有6例利福平和3例異煙肼耐藥結果為芯片法耐藥而MGIT 960藥敏法敏感，這可能的原因是與體外培養可能導致耐藥菌亞群比例下降，低于其檢測靈敏度有關[17]。也有可能與MGIT360藥敏法的利福平終濃度設置過高有關。

總之，實驗室污染、多重感染、菌株的低水平耐藥、耐藥和敏感菌落亞群比例不同或異質性耐藥存在都可能導致基因型和表型或是兩種分子法結果的不一致，異質性耐藥被認為是造成表型與基因型耐藥結果不符的重要原因[18]。目前，二代測序技術、分子克隆與數字PCR技術在臨床和科研方面也廣泛應用，本研究中的結果不一致者(包括疑似異質性耐藥)可以通過上述技術在未來的研究中進行進一步的驗證。

4 結 論

中國是耐藥高負擔國家，有效控制和降低MDR-TB總體負擔迫在眉睫，而WHO推薦的耐藥診斷產品多為進口，存在價格昂貴和戰略安全的風險。近年來在我國傳染病重大專項的支持下，國內的耐藥結核病診斷技術研發取得了顯著進展，本研究對國產耐藥檢測產品的臨床應用提供了相關資料的支持。雖然無法取代表型藥敏技術，但是芯片法其快速、準確的特點，仍適用于結核病耐藥初篩，MDR結核病患者可以通過適當的二線藥物快速治療，取得更好的療效，考慮到成本、技術專利等問題，國產芯片產品更便于基層臨床醫院的推廣。

利益沖突：無