2013-2018年河南省耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)非結(jié)核分枝桿菌流行特征分析

趙東陽(yáng)，王少華，蘇茹月，鄭丹薇，朱巖坤，馬曉光，石 潔，李 輝，孫定勇

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria bacteria，NTM)是指分枝桿菌屬內(nèi)除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis，MTB)、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌(M.africanum)和田鼠分枝桿菌(M.mictoti)以及麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)等以外的其他分枝桿菌。NTM普遍存在于環(huán)境中的土壤和水中，隨著社會(huì)發(fā)展，從城市供水系統(tǒng)和飲用水系統(tǒng)也可分離到NTM[1-2]。NTM是機(jī)會(huì)致病菌，可以引起肺部或其他器官感染，肺部感染后臨床表現(xiàn)與肺結(jié)核相似，常被誤診為肺結(jié)核病。大部分NTM菌株天然耐藥，對(duì)一線(xiàn)二線(xiàn)抗結(jié)核藥物普遍耐藥，導(dǎo)致NTM感染后治療效果不好，并且增加病人的負(fù)擔(dān)[3-4]。本研究中，對(duì)河南省耐藥監(jiān)測(cè)過(guò)程中收集的分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)物進(jìn)行了NTM分離鑒定及藥物敏感試驗(yàn)，以期了解南陽(yáng)市轄區(qū)、中牟縣、新密市、嵩縣和扶溝縣5個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的NTM分布情況、流行現(xiàn)狀及其耐藥性。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2013年1月至2018年12月來(lái)自河南省5個(gè)耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院結(jié)核病患者痰分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本1 811例，其中南陽(yáng)市轄區(qū)493例、新密市406例、中牟縣452例、扶溝縣225例、嵩縣235例，剔除30例信息不完整的病例，共1 781例納入分析。

1.2NTM初步鑒定和藥敏試驗(yàn) 采用傳統(tǒng)的對(duì)硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)法對(duì)分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)物進(jìn)行初篩及鑒定，若該菌在PNB鑒別培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，則初步判定為NTM。采用傳統(tǒng)固體比例法檢測(cè)菌株藥物敏感性：接種環(huán)刮取一環(huán)菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物，細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀(BACspreaderTM1100，體必康)超聲分散，用生理鹽水配制成1.0麥?zhǔn)蠞舛染海♂尦?0-2和10-4CFU/mL菌液，取0.01 mL各稀釋菌液接種于不同含藥培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4～8周觀察結(jié)果[5]。含藥培養(yǎng)基購(gòu)自河南賽諾特生物技術(shù)有限公司，藥物濃度分別為PNB 500 μg/mL、TCH 5 μg/mL、異煙肼(INH)0.2 μg/mL、利福平(RFP)40 μg/mL、乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL、鏈霉素(SM)4 μg/mL、卡那霉素(KM)30 μg/mL、氧氟沙星(OFX)4 μg/mL、卷曲霉素(CPM)40μg/mL、丙硫異煙胺(PTO)40 μg/mL、對(duì)氨基水楊酸(PAS)1 μg/mL。

1.3細(xì)菌基因組DNA提取 參考張婷等[6]的方法，略作改動(dòng)：刮取NTM菌落懸于超純水中，95 ℃金屬浴裂解20 min，室溫冷卻后12 000 r/min離心10 min(4℃)，取上清作為模板。

1.4探針熔解曲線(xiàn)法試驗(yàn) 采用探針熔解曲線(xiàn)法分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(廈門(mén)致善)對(duì)初篩判定為NTM菌株進(jìn)行菌種鑒定。該試劑盒可用于臨床和環(huán)境中常見(jiàn)的19種分枝桿菌的定性鑒定[7]：結(jié)核分枝桿菌(復(fù)合群)、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、龜分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、海分枝桿菌或潰瘍分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌。具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5PCR測(cè)序 16S rRNA基因擴(kuò)增上游引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列：5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司(Sangon)合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL：PCR預(yù)混液(2×Mix購(gòu)自康為世紀(jì)公司)25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板5 μL，無(wú)菌去離子水16 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 10 min；然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s共計(jì)25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。同時(shí)擴(kuò)增H37Rv作為對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。由Sangon公司測(cè)序，并將基因序列提交美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national centerfor biotechnology information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性分析比對(duì)。菌株判定及16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1NTM菌株鑒定結(jié)果 1 781例分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)物中，67例在PNB和TCH鑒別培養(yǎng)基上均有分枝桿菌生長(zhǎng)，初步判定為NTM。67株菌株經(jīng)探針熔解曲線(xiàn)法和測(cè)序鑒定，有2株為結(jié)核分枝桿菌。65例NTM中，胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)49例(75.4%)，堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)5例(7.7%)，膿腫分枝桿菌(M.abscessus)3例(4.6%)，鳥(niǎo)分枝桿菌(M.avium)2例(3.1%)，敗血癥分枝桿菌(M.septicum)(1.5%)，結(jié)核分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌混合感染5例(7.7%)，見(jiàn)表1。NTM菌株16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約900 bp，目的條帶單一，具有較好的擴(kuò)增效果，圖1。NTM菌株與從GenBank下載的5株相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株或代表株的16SrRNA序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，菌株均得到良好區(qū)分，見(jiàn)圖2。

表1 65例NTM臨床標(biāo)本鑒定結(jié)果

M為DL2000；1-8為臨床菌株；9為陽(yáng)性對(duì)照H37Rv；10為陰性對(duì)照

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2NTM感染率及變化趨勢(shì) 2013-2018年分枝桿菌標(biāo)本中NTM感染率分別為2.0%、3.3%、3.6%、4.4%、5.1%、4.9%，呈逐年上升的趨勢(shì)(χ2=5.647，P<0.05)，各年之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.043，P>0.05)，見(jiàn)圖3。南陽(yáng)市轄區(qū)、新密市、中牟縣、扶溝縣和嵩縣5個(gè)檢測(cè)點(diǎn)NTM感染率分別為5.2%、2.7%、4.3%、1.9%、4.5%，見(jiàn)圖4，各地之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.043，P>0.05)。

圖3 2013-2018年NTM感染率

圖4 五地區(qū)NTM感染率

2.3NTM感染患者性別、年齡和初復(fù)治分布 1 781例病人中，男性感染率為3.8%(53/1 388)，女性感染率為3.1%(12/393)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.510，P>0.05)。年齡范圍16～95歲，50歲以下患者感染率為2.3%(20/840)，50歲以上的患者感染率為4.8%(45/941)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.303，P<0.01)。初治病人感染率為2.2%(24/1 097)，復(fù)治病人感染率為6.0%(41/684)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.359，P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.4NTM藥敏試驗(yàn)結(jié)果 NTM對(duì)9種抗結(jié)核藥物均具有較高的耐藥率，見(jiàn)表3。65株NTM中耐多藥菌株和廣泛耐藥菌株分別達(dá)到95.4%(62/65)、89.2%(58/65)。

表2 NTM感染患者性別、年齡和初復(fù)治分布

表3 65例NTM菌株對(duì)抗結(jié)核藥物耐藥率

3 討 論

已經(jīng)報(bào)道的NTM已經(jīng)超過(guò)190種，新種仍在不斷被鑒定發(fā)現(xiàn)[9]。本研究經(jīng)PNB/TCH初篩生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)鑒別為NTM的67株菌株，經(jīng)探針熔解曲線(xiàn)法鑒定發(fā)現(xiàn)2例為結(jié)核分枝桿菌，表明PNB/TCH鑒定存在假陽(yáng)性，還需要通過(guò)分子生物學(xué)方法鑒定分離的NTM。探針溶解曲線(xiàn)法[6]能夠鑒定常見(jiàn)的NTM，并且可以發(fā)現(xiàn)混合感染，操作簡(jiǎn)單，不足的是對(duì)不常見(jiàn)菌株仍要進(jìn)行測(cè)序鑒定。65例NTM感染病例中，胞內(nèi)分枝桿菌占比75.4%，其它占比24.6%，胞內(nèi)分枝桿菌是耐藥監(jiān)測(cè)地區(qū)的優(yōu)勢(shì)感染菌株。研究報(bào)道甘肅[10]、浙江[11]、云南[12]、沈陽(yáng)[13]等地的NTM優(yōu)勢(shì)感染菌均為胞內(nèi)分枝桿菌，比例分別為67.92%、52.15%、44.83%、38.9%，低于耐藥監(jiān)測(cè)地區(qū)。而上海[14]和重慶[15]NTM感染則以堪薩斯結(jié)核分枝桿菌、膿腫分枝桿菌為主，占比分別為45.0%和39.54%。這表明不同地區(qū)的NTM優(yōu)勢(shì)流行菌群不一樣，NTM流行菌種和比例差異可能與當(dāng)?shù)刈匀粴夂驐l件等因素相關(guān)。

目前國(guó)際上關(guān)于NTM感染情況的報(bào)道逐漸增多，感染率逐步升高[16-18]。我國(guó)歷次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，NTM感染率呈上升趨勢(shì)，2010年進(jìn)行的第5次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查NTM的感染率達(dá)到了22.9%[19-20]。本研究從2013年到2018年河南省5個(gè)耐藥檢測(cè)點(diǎn)1 781例患者痰標(biāo)本分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)物中，鑒定出60例單一NTM感染和5例混合感染，總感染率為3.6%(65/1 781)。NTM總感染率遠(yuǎn)低于第5次流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果的22.9%，也低于杭州地區(qū)的21.4%[21]、福建的30.19%[22]；高于沈陽(yáng)的1.87%[13]、天津的1.84%[23]、湖北的2.21%[24]。NTM的感染率從2.0%上升到5.0%左右，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。杭州[21]、沈陽(yáng)[13]的研究結(jié)果顯示NTM的感染率呈上升趨勢(shì)，而天津[23]和湖北[24]的研究結(jié)果表明NTM感染率無(wú)明顯增高趨勢(shì)。5個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)中南陽(yáng)市轄區(qū)感染率最高為5.2%，扶溝縣最低為1.9%，感染率也各不相同。這表明NTM的感染率隨著地域變化而變化，部分流行地區(qū)比例呈逐步上升趨勢(shì)。

本研究中1 781例病人中，年齡為50歲以上的患者感染率高于50歲以下人群，云南[12]、杭州[21]等地NTM感染者也是年齡50歲以上占優(yōu)勢(shì)。這表明隨著年齡增高，免疫水平降低，更容易被感染。本研究中復(fù)治病人感染率為6.0%，高于初治病人，與Xu等[25]的報(bào)道一致，表明患過(guò)結(jié)核病的病人更容易受到NTM的感染。

對(duì)分離的NTM進(jìn)行了9種一線(xiàn)、二線(xiàn)抗結(jié)核藥藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，65例NTM對(duì)INH的耐藥率為100%，對(duì)RFP、SM、OFX、CPM、PAS的耐藥率超過(guò)了80%；耐多藥率達(dá)到95.4%，廣泛耐藥率達(dá)到89.2%。NTM菌株對(duì)抗結(jié)核藥物表現(xiàn)了普遍耐藥性，與以前的報(bào)道結(jié)果基本一致[10,13,15]。NTM與結(jié)核分枝桿菌雙重感染表現(xiàn)出與NTM單獨(dú)感染相似的耐藥表型[25]，本研究中5例混合感染藥敏結(jié)果全為廣泛耐藥，容易造成病人的誤診誤治。因此，臨床上遇到NTM感染病例首先需要進(jìn)行菌種鑒定，然后再進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，以確定適當(dāng)?shù)闹委煼桨浮?/p>

本研究尚存在一些不足之處，比如取樣點(diǎn)數(shù)目少，局限于5個(gè)縣區(qū)，需要擴(kuò)大納入范圍，才能全面的反映河南省NTM流行情況；由于病人追蹤隨訪(fǎng)困難，研究?jī)H鑒定了NTM感染菌株類(lèi)型，不能確定患者感染NTM后發(fā)病與否，因此這些問(wèn)題都需要更深入的研究。

綜上，河南耐藥監(jiān)測(cè)地區(qū)近年流行的NTM菌種以胞內(nèi)分枝桿菌為主。NTM感染者中男性多于女性，復(fù)治患者多于初治患者，中老年人易感。NTM臨床菌株對(duì)常用抗結(jié)核藥物普遍耐藥，臨床上需要提高對(duì)非結(jié)核分枝桿菌病的認(rèn)識(shí)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷，及時(shí)調(diào)整病人的治療方案。

利益沖突：無(wú)