絳蟲基因組學研究進展

李秀榮，閆鴻斌，李 立，付寶權,2，薄新文，朱興全，賈萬忠,2

絳蟲屬于三大類蠕蟲之一，因其種類眾多，生物學特性各異，分布廣泛，對人和動物危害嚴重，數據表明，全球棘球蚴病和囊尾蚴病的負擔為每年數以百萬計的傷殘調整生命年，給畜牧業帶來巨大的經濟損失[1]。由于缺乏有效的早期診斷方法和治療藥物，絳蟲病容易被忽視，患病后通常難以治療，而且是致命的。絳蟲的生活史，除了個別寄生在人類和嚙齒動物的絳蟲可以不需要中間宿主外，寄生在家畜的絳蟲，其發育需要1個或2個中間宿主，才能完成其整個生活史。因其特別的生活史，成為研究寄生蟲生長發育、入侵、寄生、致病等機理的理想模式生物[2]。

隨著分子生物學和生物信息學的日臻完善，人類、動植物和微生物的基因組研究得以迅猛發展。近年來，寄生蟲的基因組計劃也引起了寄生蟲學家的極大興趣。通過寄生蟲基因組計劃，將會幫助科學家對生物學中的寄生現象有一個更加全面的理解，同時為人類的健康和經濟的發展提供保障。

1 絳蟲基因組測序現狀

絳蟲的基因組包括核基因組和線粒體基因組，本文提及的基因組指前者。自2004年起，開始了絳蟲全基因組的測序工作，包括多房棘球絳蟲、細粒棘球絳蟲(G1)、加拿大棘球絳蟲(G7)、微口膜殼絳蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲、亞洲帶絳蟲等基因組序列測定的完成并進行了公開發表，肥頭帶絳蟲基因組序列的匯編和注解正在進行中，還有其他一些絳蟲基因組序列測定正在進行中(表1)。隨著棘球絳蟲基因組的接近完成，以及絳蟲基因組的進一步完善，研究人員開始探索它們的全部內容、結構和一般特征[3]。這將有助于解決一些基礎性問題：1)物種的起源和進化；2)絳蟲宿主特異性和組織特異性及其變化的分子基礎和機制；3)絳蟲致病機制；4)絳蟲逃避宿主免疫應答的機制；5)絳蟲生活史過程中為適應宿主在不同分化階段控制其基因表達的信號調控機制；6)疾病預防和診斷的抗原譜或者分子遺傳標記的篩選；7)新藥物設計時絳蟲與宿主代謝途徑上的異同分析和藥物靶標篩選。

表1 已完成基因組測序的絳蟲種類及相關信息[4-9]

2 絳蟲基因組特征

目前已經測序的絳蟲中除微口膜殼絳蟲染色體數目為2N=12外，其余絳蟲染色體數目均為2N=18[9]，基因組大小多為115～170 Mb(見表2)，比秀麗隱桿線蟲基因組(約100 Mb)稍大[11]，是曼氏血吸蟲基因組(約380 Mb)的1/3。絳蟲為了適應寄生生活，其基因組也發生了適應性進化，基因組中重復序列少，但歐猥迭宮絳蟲等例外[5,10]。不同絳蟲基因組之間GC堿基含量差異明顯，從表2可以看出，其他絳蟲的GC含量都在43%左右，顯著高于微口膜殼絳蟲。通過鑒定多房棘球絳蟲全基因組可知，共有308個潛在多順反子，多順反子中基因的排列次序在絳蟲之間、絳蟲和吸蟲之間較為相似[12]。在營寄生生活的扁形動物中，持家基因的數目大幅減少，絳蟲是持家基因丟失最多的一類物種，其特異性缺失基因中有一些是參與神經發育的基因家族，也喪失了一些參與消化道形成的ParaHox基因和參與發育的Wnt補充物[13]。在絳蟲基因組也有擴充，主要擴充基因家族為熱休克蛋白70(Hsp70)家族。棘球絳蟲和豬帶絳蟲細胞質Hsp70進化枝的基因擴充數目最多，總拷貝數分別達到22和32個，而人只有2個和6個Hsp70基因。絳蟲Hsp70缺乏典型細胞質Hsp70特征，例如不含EEVD基序和GGMP重復單元，同時表達水平很低，幾乎不表達，而典型細胞質Hsp70在不同的生活史階段呈組成性表達，這些基因家族與絳蟲的營養吸收、宿主環境適應等機制相關[5]。絳蟲有一新的Argonaut亞家族蛋白，它可能結合一個新發現潛在小RNA前體分子，有研究發現棘球絳蟲Ago蛋白位于Piwi結構域“DEDH”中[14]，這對于該蛋白在靶mRNA上的剪切活性至關重要。

表2 7種重要帶科絳蟲基因組總體特征

3 表觀基因組學研究

表觀基因組學是利用全基因組測量來表征真核生物的染色質狀態和DNA修飾，主要使用DNA微陣列或深度測序方法對核酸群體(無論是DNA還是RNA)進行全面分析[15]。絳蟲具有傳遞表觀遺傳信息的第二遺傳系統，與DNA鏈中核苷酸堿基序列的遺傳并行。表觀遺傳至少基于4種信息載體：通過胞嘧啶甲基化介導的DNA的化學修飾，組蛋白和其他染色質蛋白的修飾，非編碼RNA和基因在細胞核中的相對位置[16]。表觀遺傳信息具有相對可塑性，并且可以直接受環境刺激的影響[17]，表型可以由基因型和表觀基因型共同編碼。表觀基因型可以通過環境的變化而改變，環境既是表型改變的有道因子，也是選擇因子[18]。從理論上講，擁有雙重遺傳系統的物種進化速度快于只具有基因型遺傳能力的物種。許多寄生蟲能夠利用雙重遺傳系統，從相同的基因型種群中呈現多種表型變異[19]。測序(ChIP-Seq)后的DNA甲基化和染色質免疫共沉淀，通過表觀遺傳基因的定位解讀基因活性和表達以及染色質狀態。寄生蟲的表觀遺傳學研究大多與瘧疾和血吸蟲病有關，只有少數與腸道寄生蟲有關。在旋毛蟲中，鑒定出甲基化DNA，以及DNA甲基轉移酶或其編碼基因的存在[20]。此外，在蠕蟲誘導的免疫抑制中證實了表觀遺傳宿主過程的調節[21]。絳蟲未來表觀基因學的研究將為人們更好地提供環境信號與寄生蟲傳感器和執行分子之間的可能聯系，它們決定不同的寄生蟲發育和毒力編程[22]，這些結果將為我們提供疾病干預的潛在機會。

4 絳蟲miRNA研究

小RNA(micro RNA)是一類參與調節寄生蟲生長發育、寄生蟲感染和免疫以及宿主-病原體相互作用的調節性非編碼RNA。采用測序方法，在豬帶絳蟲后絳幼蟲鑒定出47個保守的miRNA和4個新的miRNA。miRNA的核苷酸偏倚分析顯示腺嘌呤(A)是miRNA起始處的顯性核苷酸，特別是在第3和第7核苷酸的位置[7]。不同miRNA家族之間的豐度差異顯著，可能是由于組織或發育階段特異性表達。在秀麗隱桿線蟲中，miR-71含量豐度高，調控發育和壽命[23-24]。在扁形蟲中，日本血吸蟲miR-71在卵中高表達，而在雌性成蟲中低表達，說明其在胚胎發育中起作用[25]。miR-71是棘球蚴不同生命周期階段中表達量最高的一種miRNA[26]。研究表明，多房棘球絳蟲miR-71在原頭節發育的不同階段存在差異表達，提示其在原頭節發育中發揮重要作用[27]。47個miRNA在其他絳蟲中也被發現，不是棘球絳蟲特異的。鑒定的miRNA屬于34個不同的miRNA家族，其中miR-2家族由miR-2a、miR-2b-3p、miR-2b-5p、miR-2c-3p、miR-2c-5p、miR-2d-5p這6個成員組成。進一步分析發現，同一家族中某些成員也存在較大差異，提示miRNA家族中存在功能差異[25]。絳蟲基因組的擴展測序，可能解決有關絳蟲預防和控制問題，通過確定新的藥物和疫苗靶標以及診斷測試、分析寄生蟲宿主的相互作用，從而中斷或阻斷寄生蟲的免疫逃避。

5 基于蛋白質的基因組學

在囊型棘球絳蟲包囊中，抗原結合是最具代表性的分子功能，并發現天然免疫應答蛋白功能。它們是不同類型的免疫球蛋白，與先天免疫有關。運用質譜(MS)的分析方法，對蛋白質進行鑒定和定量[28-30]，鑒定的85種蛋白中有6種匹配到細粒棘球絳蟲物種。在囊壁中，184個蛋白中有3個和卵細胞匹配，即磷脂酶D1、Ras相關蛋白Rab6B和肌聯蛋白，并發現了許多參與免疫應答的蛋白質。其中囊壁的30種蛋白質中，囊腔中不存在人類白細胞抗原(HLA)組織相容性抗原I和II類[30-32]。科特氏中殖孔絳蟲的成蟲和幼蟲的蛋白質組學比較研究發現，在鑒定的蛋白中，幼蟲和成蟲共有207個蛋白，其中157個是階段特異性蛋白，31個來自幼蟲，126個來自成蟲。幼蟲的功能主要與基礎代謝有關，通過無性繁殖，負責生長和營養發育。成蟲具有更廣泛的功能，包括大分子生物合成過程、基因表達和控制途徑[33-34]。絳蟲蛋白質不僅在模式生物中存在，其他絳蟲中也存在，通過對其時空表達模式研究，一些已識別的階段特異性蛋白與特定的組織、結構或分化過程相關。幼蟲期和成蟲期蛋白質有明顯的生物學差異，這可能和與寄生蟲在不同宿主體內代謝的變化有關[35]。利用這些技術可以了解疾病和其在宿主條件下的細胞和分子機制，以及蛋白質生物標志物篩選提供有關絳蟲分子入侵宿主過程的功能信息，這些過程與寄生蟲的生存和發育有關。

6 藥物靶標

利用生物信息學方法分析絳蟲基因組和用藥物處理前后蛋白質變化差異，可以發現寄生蟲的基因(特別是必需基因)可能就是抗寄生蟲藥物的潛在靶標或新藥物作用靶點[35]。分析豬帶絳蟲(T.solium)基因組序列，成蟲階段的16 000條EST序列中，與人類1.5%序列無同源性，這些基因成為豬帶絳蟲藥物治療、診斷、疫苗研制的候選基因[36]。通過結合基因組的代謝網絡和在電腦模擬分析來確定藥物靶點，發現血吸蟲的胞苷酰轉移酶可以作為藥物靶標分析，開發一種血吸蟲胞苷轉移酶特異性抑制劑[35, 37]。氯喹和青蒿素作用后惡性瘧原蟲，運用蛋白組學方法分析滋養體階段蛋白質表達變化，發現蛋白質數量增加了30%，部分蛋白質在藥物作用下表達量發生應激性變化，蛋白質組學方法可用于抗寄生蟲藥物作用機理的研究[38]。絳蟲和吸蟲的酶-硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(TGR)是吸蟲內一個必需的蛋白，并證實可以作為藥物靶標[5]。對棘球絳蟲115個保守蛋白質進行GO富集分析，發現這些蛋白具有催化或結合功能。加拿大棘球絳蟲所對應的蛋白質藥物靶標與細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲有很高的同一性。篩選出42種絳蟲高度保守性蛋白，作為潛在的藥物靶標，主要是涉及防御、抗原、轉錄、新陳代謝、信號分子、運輸和保守性較好蛋白質[4,39]。絳蟲基因組學和蛋白質組學分析，鑒定出來的差異蛋白主要與營養攝取、信號轉導及免疫逃避應答等重要生理過程有關，為藥物靶標、疫苗候選分子、診斷抗原的篩選奠定了基礎。

7 展 望

絳蟲棘球蚴病是一類重要的人獸共患病，阻礙了社會經濟的發展，造成畜牧業的經濟損失。隨著基因組學和生物信息學的發展，絳蟲基因組的研究為絳蟲和宿主之間的作用機制提供了更廣闊的視角，了解寄生蟲的寄生機制，為絳蟲病的診斷提供新的依據。有關機構已經對多房棘球絳蟲、細粒棘球絳蟲、豬帶絳蟲、微口膜殼絳蟲、猬迭宮絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲完成并公布全基因組測序結果[5,7]，從基因組學層面，絳蟲的機制研究對絳蟲疾病的發展以及人類的健康等具有重要意義。但是關于絳蟲的免疫逃避、宿主蛋白消化、入侵過程中的分泌蛋白酶等[7,40-41]的作用機制還待研究。

隨著基因組學和生物信息學的發展，全基因組分子標記的發展將使從野外采集的寄生蟲中更準確地估計種群遺傳和重組參數，從而更好地研究絳蟲和其他血吸蟲在人類或宿主之間的傳播[16, 42]。一些棘球絳蟲中，進化枝特異性肌醇-五磷酸鹽2-激酶(IP2K)在細胞外壁中產生肌醇六磷酸鹽沉積物，保護幼蟲的絳蟲蚴[43]，同時沉積物增加了吸附宿主蛋白的表面積，促進與宿主的相互作用增加了吸附宿主蛋白的表面積[44]。在蠕蟲中，可以觀察到四肽家族的擴展，四肽家族是宿主體內蠕蟲釋放囊泡的一部分，免疫原性較高[45]。絳蟲中包含2個具有三磷酸腺苷雙磷酸酶結構域的擴增家族，這2個家族可能參與從受損宿主組織中水解ATP[46]。同時絳蟲的表面糖蛋白可能與天然免疫細胞上的凝集素受體以抑制方式相互作用[45, 47]，通過修飾直接暴露于免疫系統的寄生蟲表面分子來逃避或轉移宿主免疫。加拿大棘球絳蟲的基因測序和注釋好的完成，證明加拿大棘球絳蟲(G7)的基因組與其他的棘球絳蟲基因組是高度同源，這些基因和蛋白質可能成為開發新的治療干預措施或新的生物藥物成分的潛在藥物靶點[4,6]。基于上述對絳蟲基因組學的研究，可能會發現絳蟲感染的標志物，為絳蟲病的診斷提供參考依據。但是，關于絳蟲、環境和宿主三者之間的關系，基于基因組學的研究方法需要改革創新。

利益沖突：無