古細菌Halobacterium salinarum耐熱因子的研究

張栩 崔珊珊

摘? 要：該研究使用的Halobacterium salinarum是極端嗜鹽菌的模型生物之一。通過對菌熱處理后，添加培養濾液，進行37℃振蕩培養，測量OD600值觀察菌的生長情況，以確定該菌是否含有耐熱因子及探討了該菌培養濾液中所含成分對該菌生長繁殖的影響。結果，80 ℃熱處理后，如果不添加培養濾液，該菌不生長;添加培養濾液時，從第十天左右開始，OD600≈0.2～0.3，并且通過顯微鏡的觀察，確認了菌的存在。另外，將培養濾液用活性炭進行吸附，再用乙醇進行溶出后的效果也進行了研究。結果顯示：將100%的乙醇溶出液分別加入熱處理菌后進行培養，結果70 ℃的熱處理菌有生長延遲的傾向。可以推斷出：培養濾液中有可能存在某種阻礙該菌生長的成分。根據該研究，明確證實了培養濾液中既含有Halobacterium salinarum的生長促進因子，又含有阻礙因子。通過分析這些成分，期待可以將休眠機制解釋清楚并對該菌以外的極端嗜鹽菌的耐熱性的研究提供研究基礎。

關鍵詞：極端嗜鹽菌? Halobacterium salinarum? 耐熱因子? 培養濾液

中圖分類號：Q939??????????????????????????? 文獻標識碼：A??? ???????????? 文章編號：1672-3791（2021）01（a）-0094-03

Study on Heat Resistance Factor of Halobacterium Salinarum

ZHANG Xu?? CUI Shanshan

（Changchun Polytechnic， Changchun， Jilin Province， 130000 China）

Abstract： Halobacterium salinarum is a model organism of extreme halophiles. In this study， firstly， we collected the culture filtrate of the halophile culture solution which continued to shake culture at 37 ℃ after heat shock at different temperature. Then we continue to culture the heat-activated halophile by using the medium with the culture filtrate， and observed the growth by measuring the OD600 value to determine whether the halophile contains heat-resistant factors. Simultaneously exploring the effects of the components contained in the culture filtrate on the growth and reproduction of the halophile. Results： After heat treatment at 80 ℃， only when the culture filtrate was added， the halophile began to grow from about the tenth day， OD600≈0.2～0.3， and the presence of the halophile was confirmed by microscopic observation. Further， the effect of culture filtrate adsorbed by activated carbon and dissolved by ethanol was also studied. As a result， 100% ethanol solution was added to the heat-treated halophile for culture， which at 70 ℃ tend to have a delayed growth. It can be inferred that there may be some components in the culture filtrate that hinder the growth of the halophile. According to the present study， it was clearly confirmed that the culture filtrate contained both the growth promoting factor and the inhibitory factor of halophile. By analyzing these components， it is expected that the dormancy mechanism can be explained clearly and the research basis for the study of the heat resistance of other extreme halophiles is provided.

Key Words： Extreme halophiles; Halobacterium salinarum; Heat resistance factor; Culture filtrate

最早記載極端嗜鹽菌存在的是《本草綱目》中記載的“引清水注入，久則色赤。待夏秋南風大起，則一夜結成，謂之鹽南風”[1]。這句話指：鹽水被太陽照射濃縮的階段逐漸變紅，經過一夜的南風食鹽的結晶析出來的意思。根據現在的知識，指含有菌紅素的極端嗜鹽菌繁殖，鹽水變成紅色的意思。1914年，Pierce首次確切地描述了鹵水中的紅色細菌[2]。

該研究使用的Halobacterium salinarum是極端嗜鹽菌的模型生物之一。一直以來認為，極端嗜鹽菌在40 ℃左右最易生長，在55 ℃以上的環境中不能生存。但是在2003年龜倉正博指出，利用海水曬鹽法制鹽時，在高溫鹽溶液中也有極端嗜鹽菌的存在[3]。并且，根據日本教育大學中山匡研究室的研究表明，Halobacterium salinarum在至少70 ℃、10 min處理后雖然比沒有熱處理的菌的生長開始時間晚，但是能夠繁殖。從這個結果可以看出，極端嗜鹽菌具有耐熱性。該實驗通過研究Halobacterium salinarum培養濾液對不同溫度處理菌的生長繁殖的影響，確定了培養濾液中含有能夠使該菌從休眠狀態復蘇的有效成分，為進一步研究該菌的休眠機制及耐熱因子的研究奠定基礎。

1? 實驗器材

離心機、振蕩培養搖床、分光光度計、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、活性炭柱、自動分液收集器、顯微鏡。

2? 實驗試劑

實驗試劑：乙醇、苯酚、濃硫酸。

復合培養基：分別制備Solution A（NaCl 200 g，KCl 2.0 g，Citrate Na 3.0 g，MgSO4·7H2O 20 g，MnCl2·4H2O（3.6 g/L），FeSO4·7H2O（0.5 g/L）1.0 mL，加入蒸餾水，定容為800 mL）與Solution B（Yeast extract，10 g，Casamino acid 7.5 g，加入蒸餾水，定容為200 mL），調整pH=7.0，121 ℃，15 min高壓滅菌后混合。

Salt solution：制備Solution A（KCl 4.0 g，NaHCO3 0.2 g，NaBr 0.5 g，加入蒸餾水，定容為200 mL）、B（NaCl 250 g，加入蒸餾水，定容為700 mL）、C（NH4Cl 2.0 g，FeCl3·6H2O 0.05 g，KH2PO4 0.5 g，加入蒸餾水，定容為100 mL），Solution A、C分別調整為pH=7.0，Solution A、B 121 ℃，15 min高壓滅菌。Solution C膜過濾除菌。無菌條件下將Solution A、B、C混合。

3? 實驗步驟

在55 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃熱處理嗜鹽菌Halobacterium salinarum 10 min，在液體培養基中37 ℃培養14天，吸光度OD600的測定菌體生長情況。結果見圖1。將該菌第4天（對數生長期后期）的培養物進行膜過濾，收集培養濾液約40 mL。

對該菌分組進行70 ℃、80 ℃、90 ℃ 10 min熱處理，在加入上述培養濾液的復合培養基繼續培養14天，測定菌體生長情況。

將收集的培養濾液流過自制活性炭柱，再用20%乙醇溶出活性物質，離心濃縮，將溶出液稀釋為?????? 1.5 mg/mL，膜過濾除菌。40%、60%的乙醇溶出液制作方法相同，取該菌1 mL，加入Salt solution調節至OD600=4.0。取10支滅菌ep管，其中5支不加熱為對照組，另外5支加入800 μL Salt solution，加熱，達到至 80 ℃，加入本菌200 μL，80 ℃、10 min，迅速冷卻。隨后分別接種1～15 mL復合培養基中（內含10%不同濃度的乙醇溶出液），37 ℃振蕩培養。結果見圖2。

與上述操作相同，將熱處理溫度分別設定為70 ℃、80 ℃和90 ℃，添加100%乙醇溶出液。

4? 實驗結果

具體情況見圖1、圖2。

5? 分析討論

對Halobacterium salinarum進行80 ℃、10 min熱處理后，如果不添加培養濾液，該菌不生長;添加培養濾液時，從第10天左右開始，OD600≈0.2～0.3，并且通過顯微鏡的觀察，確認了該菌的存在。從以上事實可以看出，在培養濾液中，存在著某種打破菌的休眠狀態的成分。將培養濾液用活性炭進行吸附，再分別用20%、40%、60%、100%的乙醇進行溶出后的效果也進行了研究。結果顯示：將100%的乙醇溶出液分別加入到????? 80 ℃、90 ℃、100 ℃的熱處理菌進行培養，80 ℃和???? 90 ℃的熱處理菌沒有生長;70 ℃的熱處理菌有生長延遲的傾向。從此實驗結果可以推斷出：培養濾液中有可能存在某種阻礙本菌生長的成分。在后續實驗中考慮分離提取出有效成分，并進一步分析鑒定其性質。根據本研究，再次證實了Halobacterium salinarum至少在?????? 70 ℃、加熱10 min的條件下仍可生長;并明確證實了培養濾液中既含有Halobacterium salinarum的生長促進因子，又含有阻礙因子。目前已經發現了極端嗜鹽菌中耐鹽基因片段和質粒[4]決定其具有嗜鹽性，那么，決定其嗜熱性的主要因素是什么還需要進一步研究。

根據以往的研究，Halobacterium salinarum在經過熱處理之后，細胞表層的構成物質表層蛋白（S-layer）發生了變化。在此基礎上，如果能夠證明極端嗜鹽菌的耐熱性和與嗜熱菌之間的關系，可以期待系統發生樹的重建。該菌既具有極端嗜鹽性又具有一定程度的耐熱性，考慮與其是多倍體有關，因此具有更高效的DNA雙鏈修復系統和極低的自發突變率，因此在極端環境下的適應能力超出其他生物[5]。也正是由于極端嗜鹽菌生存環境的特殊性，其保存有一定的困難。今后考慮加入蔗糖、海藻糖優化其冷凍干燥條件[6]，提高實驗的準確性和平行性。

參考文獻

[1]?李時珍.本草綱目[M].武漢：湖北科學技術出版社，2018.

[2]?Aharon Oren， Rahel Elevi， Satoshi Watanabe， et al. Halomicrobium mukohataei gen. nov.， comb.nov.， and emended description of Halomicrobium mukohataei[J]. Int J Syst Evol Microbiol，2020，52（5）：1831-1835.

[3]?龜倉正博，古賀洋介.古細菌的生物學[M].東京：東京大學出版社，1998.

[4]?Pallen，Mark.Genome Sequence of an Extreme Halophile[J].Trends in Microbiol，2020，9（2）：58-59.

[5]?王殿年，段嘉偉，劉艷明，等.一種高可靠性環氧樹脂組合物的制備[J].電子與封裝，2020，20（10）：11-14.

[6]?劉媛媛.小麥WRKY轉錄因子的鑒定分析與耐熱相關基因的初步研究[D].西北農林科技大學，2019.

[7]?毛建.環氧樹脂耐熱模型與硬質鏈段增韌改性的研究[D].武漢理工大學，2016.