幽門螺桿菌相關萎縮性胃炎的區域耐藥性分析

賀新國，郭保根

成都市雙流區中醫醫院消化內科，四川 成都 610020

慢性胃炎主要由幽門螺桿菌(H.pylori，Hp)感染所引起，感染Hp后少有自發清除，因此慢性胃炎長期持續存在，部分發展為慢性多灶性萎縮性胃炎，胃癌的發生危險明顯高于普通人群[1]。不同地區，不同人群抗生素耐藥差異較大，盲目濫用抗生素更易增加細菌耐藥[2]。研究發現，標準的質子泵抑制劑(PPI)三聯療法對Hp 感染的根除率在少數地區已呈明顯下降趨勢，部分歐洲國家的Hp感染根除率已低于80%[3]。通過藥敏試驗選擇敏感抗生素是提高Hp根除率的有效方法，但標準的細菌培養+藥敏實驗由于培養條件的限制，不宜在臨床展開。本研究通過使用靈敏度高、特異性好的RT-PCR 方法和基因芯片檢測法，針對萎縮性胃炎患者，檢測胃鏡活檢標本中Hp 及其對常用抗菌藥物的耐藥性，了解與萎縮性胃炎相關性強的Hp耐藥水平及耐藥基因突變情況，旨在為本地區的Hp的根除治療治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年6 月至2020 年6月在成都市雙流區中醫醫院消化內科經胃鏡檢查確診的Hp相關萎縮性胃炎患者210例，其中男性115例，女性95 例，分離得到菌株200 株。納入標準：初次到醫院就診并行胃鏡檢查者；之前未曾接受Hp 感染根除治療；年齡18～80 歲；診斷符合慢性萎縮性胃炎(中國慢性胃炎共識意見2012年)。排除標準：近2周內服用過抗生素、激素、抑酸藥、鉍劑；嚴重的心肝肺、腎臟疾病者；有胃部手術史者。本研究經醫院倫理審查委員會同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 Hp鑒定 胃鏡檢查時，同時取2部位組織進行檢測(胃竇和胃體各2塊)，立即置于10%中性甲醛溶液中固定，送病理科檢測。①HE染色觀察：胃鏡活檢組織經10%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋后進行常規切片、HE 染色，鏡下觀察，排除急性、慢性炎癥及潰瘍性病變。②改良Giemsa Hp染色觀察：采用Hp染色試劑盒(Giemsa法，北京益利精細公司)，操作步驟按說明書進行，鑒定Hp。

1.2.2 Hp 藥敏試驗 采用紙片擴散法進行藥敏試驗，調整菌懸液濃度至6×107CFU/mL，均勻涂抹于酪蛋白綿羊血平皿(成都精博瑞生物科技有限公司)，貼上藥敏試紙后置于微需氧袋，37℃溫度下培養3 d，測量抑菌圈直徑，參照中國食品藥品檢定研究院制定的抗菌藥物藥敏試驗判定標準判斷Hp對常規抗生素的耐藥情況。

1.2.3 RT-PCR方法檢測Hp及其耐藥性 ①組織DNA 提取：胃組織蠟塊切10 um 厚蠟卷，按照QIAamp DNA mini kit(Qiagen,Germany)，試劑盒操作步驟提取組織DNA。②RT-PCR 擴增及耐藥性檢測：采用RT-PCR方法，擴增Hp 23s rRNA和gyrA基因，鑒定Hp。③Hp 克拉霉素及左氧氟沙星耐藥性檢測：采用 RT-PCR，檢 測 Hp23s rRNA 基 因 V 區 A2142G、A2143G、T2182C 突變和 gyrA 基因 N87K (C261A)、D91N(G271A)突變；人RNP基因作為內對照。

1.2.4 可視化基因芯片檢測Hp 對克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥表型和基因型 提取胃黏膜DNA，制備基因芯片(深圳普瑞康研制開發的幽門螺桿菌感染個體化治療檢測試劑盒(基因芯片法))，檢測本地區幽門螺桿菌對克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥表型和基因型。對于針對克拉霉素耐藥位點設計的4 條探針(6號、7號、8號和9號)，當某一條探針的平均灰度值為另三條的兩倍及以上時，或者只有一條探針有信號時，則判斷此條探針為陽性。針對喹諾酮耐藥位點第87位氨基酸設計的四條探針(10號、11號、12號和13號)，判讀標準同于克拉霉素耐藥位點的探針的判讀。針對喹諾酮耐藥位點第91 位氨基酸設計的三條探針(14 號、15 號和16號)，判讀標準也同于克拉霉素耐藥位點的探針的判讀。

1.3 統計學方法 應用SPSS22.0 統計學軟件分析數據，計數資料組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Hp 的耐藥清單 對分離的200 株菌株進行7 中常用抗生素的藥敏試驗，其中甲硝唑耐藥140 株(70%)，左氧氟沙星耐藥 77 株(38.5%)，克拉霉素耐藥31株(15.5%)，阿莫西林耐藥20株(10%)，呋喃唑酮、慶大霉素和四環素耐藥各2株(1%)。

2.2 HpgyrA基因N87K(C261A)、D91N(G271A)突變情況 通過對耐左氧氟沙星菌株38 株和敏感菌株10 株進行gyrA 基因序列分析，N87K(C261A)突變耐藥菌株有15 株，敏感組0 株，差異具有統計學意義(P＜0.05)；D91N (G271A)突變耐藥菌株有13 株，敏感組0株，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 HPgyrA基因N87K(C261A)、D91N(G271A)突變情況[株(%)]

2.3 Hp23s rRNA 基因 V 區 A2142G 、A2143G、T2182C 突變情況 通過對耐克拉霉素菌株31 株和敏感菌株10株進行23s rRNA基因序列分析，A2142G突變耐藥菌株17 株，敏感菌株2 株，差異具有統計學意義(P＜0.05)；A2143G 突變耐藥菌株 13 株，敏感菌株 1株，差異具有統計學意義(P＜00.05)；T2182C 突變耐藥菌株15 株，敏感菌株4 株，差異無統計學意義(P＞00.05)，見表2。

表2 Hp23s rRNA基因V區A2142G、A2143G、T2182C突變情況[株(%)]

3 討論

Hp 感染后，部分患者由慢性非萎縮性胃炎發展為慢性萎縮性胃炎，其中部分可演變發展為胃癌[4]。萎縮是從非萎縮性胃炎向癌演變過程中重要的病變階段。根除Hp 可消除炎癥反應，使萎縮發展減慢或停止。然而，隨著抗菌藥物廣泛及長時間使用，Hp 耐藥率增高，增加根除Hp 的治療難度[5]。其次，受藥物影響及檢測Hp方法的局限性，出現Hp檢驗假陰性，貽誤抗Hp治療時機，導致胃黏膜慢性炎癥持續，腺體萎縮。更為重要的是，不同國家或同一國家不同地區Hp對抗菌藥物的耐藥性差異較大，Hp相關性胃黏膜的萎縮發生率也存在很大差異，目前本地區尚無Hp耐藥率及相關性胃黏膜的萎縮發生率研究指導臨床用藥。

喹諾酮類藥物通過抑制細菌復制過中的DNA 回旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的活性發揮抑菌作用[6]。而DNA回旋酶中的A、B兩個亞單位結構分別由gyrA和gyrB 基因編碼，因此當gyrA 基因發生突變時即可影響細菌的耐藥性。gyrA 基因突變的常見方式主要是編碼 N87K(C261A)、D91N(G271A)的突變[7]。本次研究結果顯示，N87K(C261A)、D91N(G271A)突變的耐藥菌株和敏感菌株比較差異具有統計學意義。說明本地區Hp 對左氧氟沙星的耐藥性主要源于C261A、G271A 的基因突變。有研究認為，N87K、D91N的改變是Hp 耐左氧氟沙星的主要原因，與本研究結果相符合[8]?？死顾啬軌蚺cHp23s rRNA基因V區中的核糖體亞基進行結合，通過抑制肽?；D移酶的功能而阻止細菌蛋白質的合成，發揮抑菌作用[9]。當23s rRNA基因的某個點位發生突變時，核糖體結構隨之改變，影響克拉霉素與其的有效結合，進而未能阻止蛋白質合成產生耐藥性[10]。本研究結果顯示，A2142G、A2143G突變耐藥菌株和敏感菌株比較差異具有統計學意義；T2182C突變耐藥菌株和敏感菌株比較差異無統計學意義。說明本地區Hp對克拉霉素的耐藥性主要源于A2142G、A2143G 的基因突變。相關文獻指出，A2143G 突變在克拉霉素耐藥性的產生過程中期主導作用[11]，但在根除Hp的治療中卻可以和阿莫西林產生協同效應，增強治療效果，而A2142G突變則無次效果。因此，在本地區Hp 相關萎縮性胃炎的根除治療中可通過聯合用藥的方式提高Hp根除率。

綜上所述，Hp耐克拉霉素的主要原因是A2142G、A2143G 基因的突變，耐左氧氟沙星的主要原因是編碼N87K、D91N 的基因C261A、G271A 發生突變，因此，在胃鏡檢查發現上述基因突變時，應避免使用克拉霉素和左氧氟沙星，更換或聯合應用其他敏感抗生素。