HBV pgRNA定量指導安全停用核苷(酸)類似物的研究進展

劉 月 鄒志強

慢性乙型肝炎(CHB)及其引起的肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌是嚴重威脅中國人群健康的疾病[1]。目前國際公認的抗乙型肝炎病毒(HBV)藥物包括(聚乙二醇)干擾素和核苷(酸)類似物(NA)兩類，后者因給藥方便、有效率高等特點而廣泛應用于CHB患者的抗HBV治療中[2-4]。CHB是由HBV感染引起的，并且有針對病因的治療，因此理論上CHB患者的抗HBV治療是有望實現有限療程的。美國肝臟研究學會(AASLD)、歐洲肝臟研究協會(EASL)、亞太肝臟研究協會(APASL)、中國的CHB防治指南中都明確指出了無肝硬化患者的停藥標準，然而在臨床實踐中，一旦停藥，有一部分患者會出現HBV DNA的突破。目前已知共價閉合環狀DNA(cccDNA)的完全衰退提示HBV的消除，是一種接近CHB治愈的狀態[5]。雖然NA可有效抑制HBV復制，但不能直接作用于cccDNA，很難實現CHB的臨床治愈[6-7]。因此，大多數CHB患者需要長期治療。本文就HBV pgRNA定量用于指導安全停用NA的研究進展作一綜述。

1 HBV DNA及HBsAg用于指導NA安全停用的局限性

為了避免HBV DNA反彈，在停止NA治療前確定肝內cccDNA沉默或消除是必要的。但在臨床實踐中，由于檢測cccDNA需應用侵入性檢查，因此定期檢測肝內cccDNA水平并不可行[8-9]。既往研究表明，血清HBV DNA和HBsAg水平均與肝內cccDNA活性呈正相關，HBV DNA被廣泛用于判斷患者病毒學應答、療效觀察及鞏固治療后停藥的重要指標[10]。然而，在NA治療過程中，血清HBV DNA消失可能并不代表肝內cccDNA被清除或處于轉錄沉默狀態[11]。當將持續消失的血清HBV DNA作為NA停藥的前提條件時，與經常出現的治療外HBV DNA反彈和疾病復發不同，對于已達到HBsAg消失的患者，無論有無抗HBs血清轉換，復發都是相當罕見的[12]。因此，血清HBsAg的消失已被認定為抗HBV治療的理想終點[2]。近年來HBsAg定量檢測方法已經商業化，并且被廣泛用于抗HBV有效性的預測和對HBV感染的初治患者的管理[13]。但有研究顯示，HBsAg消失10年后，約14%的患者肝臟中仍可檢測出cccDNA[2]。許多因素可能是將血清HBsAg作為經NA長期治療患者肝內cccDNA轉錄活動的替代指標的障礙，如HBV DNA整合組，以及NA長期治療相關的HBsAg滯留等問題。盡管目前抗HBV藥物層出不窮，但血清HBsAg消失仍很難實現[13]。如將血清HBsAg持續消失作為功能性治愈或臨床治愈的判定標準，可能會使一些患者繼續接受不必要的抗病毒治療[11]。因此，臨床上亟需能夠提示安全停用NA的指標。

2 血清HBV RNA的存在形式及來源

1990年代初的一些研究顯示，HBV感染患者外周血單核細胞中可測得HBV RNA[14-17]，然而直到1996年，K?ck等[18]才首次在HBV感染患者的血清中發現血清HBV RNA。Wang等[19]和Jansen等[20]發現HBV感染患者血清中的HBV RNA實質上是核衣殼內未經轉錄的HBV前基因組RNA(pgRNA)，來自感染肝細胞內cccDNA的轉錄。這些含有未經轉錄pgRNA的核衣殼也可獲得病毒外膜，并可以病毒樣顆粒形式釋放。

3 HBV pgRNA與 cccDNA的關系

HBV屬嗜肝DNA病毒科(hepadnabitidae)，是一種雙鏈環狀DNA。HBV通過將肝細胞膜上的鈉離子/牛磺膽酸共轉運蛋白(NTCP)作為受體進入肝細胞[2]。HBV進入肝細胞后，首先脫去外膜，HBV DNA雙鏈形成松弛環狀DNA(rcDNA)，rcDNA進入細胞核，在細胞核中轉化為cccDNA，cccDNA作為微型染色體持續存在，并且為5種病毒mRNA的轉錄提供模板，其中3.5 kb的pgRNA也為HBV DNA負鏈的逆轉錄提供模板。HBV DNA聚合酶與pgRNA的結合提供了包裝信號，隨后使用核心蛋白組裝病毒衣殼。其后衣殼化的pgRNA經逆轉錄產生病毒DNA的負鏈，并且正鏈DNA不完全由負鏈DNA合成。新合成的rcDNA被病毒表面蛋白包圍，并被釋放成Dane顆粒，或者重新進入細胞核以補充cccDNA池[12]。cccDNA半衰期較長，難以從體內徹底清除，對慢性HBV感染起著重要作用[2]，由于cccDNA定量需要侵入性檢查，因此探索能反映cccDNA活性的替代檢測指標很重要。HBV通過pgRNA逆轉錄形成cccDNA，pgRNA也可由cccDNA轉錄生成，與HBsAg不同，HBV pgRNA僅來自于肝內cccDNA，并且其數量不受病毒抗原或抗體復雜性的影響。因此，血清pgRNA水平能反映cccDNA的狀態，包括cccDNA的水平及其轉錄活性[13,20-21]。

4 HBV pgRNA可預測HBeAg血清學轉換

長期的病毒抑制表現為HBeAg血清學轉換，可誘導一部分患者的病毒免疫抑制[22-23]。有研究表明NA治療可幫助超過60%的患者在治療后1年實現HBV DNA不可測得，少數患者能實現血清學應答(HBeAg和HBsAg消失，有或無相應抗體)[24]。即使HBV DNA維持在不可測得水平，也很難預測是否患者有血清學應答。有研究通過比較發生HBeAg血清學轉換組與未發生HBeAg血清學轉換組的血清HBV RNA水平，發現后者的血清HBV RNA水平升高,同時發現治療前血清HBV RNA水平低于4.12log10copies/mL的CHB患者更易實現HBeAg血清學轉換[25]。另有研究也發現在NA治療期間，與其他患者相比，HBeAg血清學轉換的患者的HBV RNA顯著下降[21]。血清HBV pgRNA陽性患者不能實現HBeAg清除的風險更高(HR=6.69，95%CI：1.88～23.84)[26]。上述結果提示血清HBV pgRNA是一個可在NA治療中預測HBeAg血清學轉換的獨立指標。

5 HBV pgRNA有潛力作為NA安全停用的預測指標

pgRNA是cccDNA的直接產物，其能反映肝內cccDNA的活性，并且阻斷逆轉錄不影響HBV pgRNA的合成。有研究發現，在NA治療期間，因NA干擾逆轉錄，會導致HBV RNA顆粒過度累積在肝細胞中，并且導致沒有逆轉錄顆粒的釋放；此外，還發現HBV RNA顆粒的存在與耐藥有關，認為血清HBV RNA顆粒的存在可能與HBV復制活動有關，并且有高復制活動的病毒產生大量HBV RNA，更易導致耐藥突變株的產生，因此推測血清HBV RNA水平可能與HBV復制活動有關[27]。有研究顯示，治療12周時血清HBV pgRNA是最初病毒學應答的一項新的預測指標，并且是除HBV DNA水平外唯一獨立的最初病毒學應答治療預測指標，同時證明了在治療中(12周)血清HBV DNA和pgRNA水平可能可以預測HBV的重新激活[28]。另有研究評估了恩替卡韋治療前后的患者血清HBV RNA，結果顯示治療期間實現病毒學應答的患者的血清HBV RNA水平明顯降低，這表明血清HBV pgRNA水平可預測病毒學應答[26]。作為直接反映肝內cccDNA水平的替代指標，血清HBV pgRNA水平是評估抗病毒治療有效性的指標之一，其也可用于預測停藥后的耐藥和復發[19-21,27,29]。研究表明，在終止NA治療的患者中有超過70%出現肝炎重新活動；多種邏輯回歸分析顯示，NA治療3個月后血清HBV DNA+RNA水平與HBV DNA反彈有關，還發現NA治療3個月后，與HBV DNA非反彈組相比，HBV DNA反彈組的血清HBV DNA+RNA水平較高, HBV DNA反彈組在NA治療期間維持著高HBV復制活動，與HBV RNA基因組相關的非成熟HBV顆粒不斷產生并在肝細胞中累積，治療終止后，這些非成熟HBV顆粒可能成熟并釋放，因此血清HBV DNA水平反彈在NA治療后迅速發生[27]。有研究顯示目前可檢測到的血清中HBV RNA為pgRNA[19]。上述研究結果表明，血清中HBV pgRNA水平可能與HBV DNA反彈有關。由此推測，如在NA停藥前檢測血清中的HBV pgRNA水平對患者的復發風險進行預判，將有助于甄別出那些已達到病毒學應答并在停藥后能維持病毒學應答的“部分治愈”患者，從而實現安全停藥[11]。血清HBV pgRNA水平在停藥原則和耐藥及病毒復發的預測上具有重要意義。但因不同研究團隊采用的檢測方法不完全相同，因此目前將血清HBV pgRNA作為安全停用NA的預測指標尚需更多大樣本的研究來證明。

6 小結

HBsAg既來自于cccDNA，也來自于整合基因組，HBsAg和HBV DNA不能完整代表cccDNA的轉錄活動。HBV RNA已知為pgRNA，僅來自cccDNA，可以反映cccDNA活性，結合對HBV pgRNA的全面了解，血清HBV pgRNA可能可以作為CHB患者安全終止NA治療的指標。今后還需大樣本臨床研究來證明HBV pgRNA指導NA安全停藥的可行性。