10%水楊酸軟膏微生物限度檢查方法的適用性試驗

沈秋蓮，葉財發，倪曉霞，陳錦珊

0 引 言

10%水楊酸軟膏為《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》(以下簡稱《軍隊制劑規范》)2015年版(第一冊)收載的標準制劑[1]，臨床用于治療皮脂溢出、脂溢性皮炎、銀屑病、淺部真菌病、趾疣、雞眼及局部角質增生。《中國藥典》2015年版僅收載2%、5%水楊酸軟膏，《軍隊制劑規范》雖然收載有10%水楊酸軟膏，但未明確其微生物限度檢查的具體方法，經文獻查新亦未見相關報道。鑒于10%水楊酸軟膏配制過程中容易引入微生物等污染源，因此加強質量控制至關重要。為此，筆者以《中國藥典》2015年版四部通則1105、1106及1107檢測規則為依據，通過考察供試液的稀釋劑、稀釋級及pH等因素，同時對10%水楊酸軟膏進行處理以消除其抗菌性[2-3]，最終建立微生物限度檢查方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器HH-W21-420電熱恒溫水浴箱(上海醫用恒溫設備廠)、KQ-500B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)、LDZH-150KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)、LRHS-400-Ⅲ恒溫恒濕培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)、HWS-400型恒溫恒濕培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)、電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)、78-1磁力加熱攪拌器(金壇市科析儀器有限公司)、PHS-3C酸度計(杭州雷磁有限公司)。

1.1.2 試藥水楊酸軟膏(批號：201903211、201903212、201903213，規格20 g∶2 g，聯勤保障部隊第909醫院自制)。

1.1.3 稀釋液與試劑0.9%氯化鈉注射液(批號：20191113，聯勤保障部隊第909醫院自制)，pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：1071461，廣東環凱微生物科技有限公司)，肉豆蔻酸異丙酯(批號：201908071，成都艾科達化學試劑有限公司)、二甲基亞砜(批號：180728，浙江杭州雙林化工試劑廠)，均為分析純。

1.1.4 培養基胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號：1082461)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號：1081801)、胰酪大豆胨液體培養基(批號：1082451)、沙氏葡萄糖液體培養基(批號：3106032)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(批號：1082132)、溴代十六烷基三甲銨瓊脂培養基(批號：1073801)，以上均來源于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.5 菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonaaeruginosa )[CMCC(B) 10 104]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63 501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]及黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98 003](以上均來源于中國食品藥品檢定研究院，且均為3代)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備取經30～35 ℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌胰酪大豆胨液體培養基各1 mL和經20～25 ℃培養2～3 d的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養基1 mL，分別用兩種稀釋劑(0.9%氯化鈉注射液和無菌的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)制成每1 mL含菌數不大于100 cfu的菌懸液[3-6]。

取經20～25 ℃培養5～7 d的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養物，分別加入3～5 mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的兩種稀釋劑。將孢子洗脫，再用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，分別用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的兩種稀釋劑制成每1 mL含菌數不大于100 cfu的菌懸液[3-6]。

1.2.2 供試液制備稱取供試品20 g，加至含20 mL肉豆蔻酸異丙酯、20 mL二甲基亞砜和玻璃珠的無菌三角燒瓶中，再分別加入0.9%氯化鈉注射液和無菌的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至200 mL，振搖，45 ℃水浴超聲30 min充分混勻后靜置，取水層作為1∶10供試液。從1∶10供試液中取50 mL、20 mL、10 mL，分別加入0.9%氯化鈉注射液和無菌的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分混勻，作為1∶20、1∶50、1∶100供試液。

1.2.3 微生物計數方法適用性試驗(1)以0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑，采用常規法[7-8]進行微生物計數適用性試驗：①試驗組：取制備好的供試液9.9 mL，加入試驗菌菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu，取含菌量不大于100 cfu的供試液1 mL，注入平皿中，立即傾注培養基(需氧菌總數測定用胰酪大豆胨瓊脂培養基，霉菌和酵母菌總數測定用沙氏葡萄糖瓊脂培養基)，置規定溫度培養3～5 d，每個菌株平行制備2個平皿，點計菌落數。②菌液組：用稀釋劑代替供試液，按“試驗組”的操作加入試驗菌液，點計菌落數。③供試品對照組：吸取上述制備好的供試液1 mL，用稀釋劑代替菌液，其余操作同“試驗組”，測定供試品的本底菌數。 ④陰性對照組：用稀釋劑代替供試液和菌液，其余操作同“試驗組”，以測定稀釋劑的本底菌數。(2)以0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑，采用培養基稀釋法[9-10]進行微生物計數適用性試驗:試驗組：取制備好的供試液9.9 mL，加入試驗菌菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu，取含菌量不大于100 cfu的供試液0.2 mL，注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基，置規定溫度培養3～5 d，每個菌株平行制備10個平皿，點計菌落數。供試品對照組、菌液組及陰性對照組同“常規法”操作，測定菌落數，計算回收率。(3)以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，采用常規法進行微生物計數適用性試驗:用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替0.9%氯化鈉注射液，試驗組、供試品對照組、菌液組及陰性對照組同“常規法”操作。

1.2.4 肉豆蔻酸異丙酯和二甲基亞砜的抗菌性考察按“1.2.2”項下要求制備供試液，分別在含有80 mL0.9%氯化鈉注射液和pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的無菌三角燒瓶中加入10 mL10%肉豆蔻酸異丙酯和10 mL10%二甲基亞砜，振搖混勻，即得1∶10供試液。用上述供試液，采用常規法進行微生物計數方法試驗，以5種常用菌作為試驗菌用常規法考察肉豆蔻酸異丙酯和二甲基亞砜對抗菌活性的影響。

1.2.5 控制菌方法適用性試驗分別取“1.2.2”項下制備好的1∶10供試液10 mL和“1.2.1”項下制備好的金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌菌懸液1 mL(含菌量≤100 cfu)，按《中國藥典》2015年版四部金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌檢查項下進行試驗。

2 結 果

2.1 供試液酸堿度測定結果以0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑時，1∶10～1∶100各稀釋級供試液pH值在2.30～2.81之間。以pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑時，1∶10～1∶100各稀釋級供試液pH值在5.53～6.88之間。見表1。

表1 兩種稀釋劑下各稀釋級供試液的pH值

2.2 微生物計數方法適用性試驗結果以0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑時，分別取1∶10～1∶100供試液，采用常規法和培養基稀釋法對水楊酸軟膏進行微生物計數方法試驗顯示，5種試驗菌種的回收率均低于0.5，不符合《中國藥典》2015年版四部通則要求, 見表2、表3。pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑常規法試驗顯示，5種試驗菌種的回收率均在0.5～2.0范圍內，符合《中國藥典》2015年版四部通則的要求，見表4。故以pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，取1∶10供試液1 mL，采用常規法可作為水楊酸軟膏的微生物計數方法。

表2 0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑常規法試驗回收率(n=3)

2.3 肉豆蔻酸異丙酯和二甲基亞砜的抗菌性考察結果5種試驗菌種的回收率均在0.5～2.0范圍內，符合《中國藥典》2015年版四部通則的要求。故可以用10%肉豆蔻酸異丙酯和10%二甲基亞砜作為增溶劑。見表5。

表3 0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑培養基稀釋法試驗回收率(n=3)

表4 pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑常規法試驗結果(1∶10供試液，n=3)

表5 肉豆蔻酸異丙酯和二甲基亞砜在兩種稀釋劑下的試驗回收率(n=3)

2.4 控制菌方法適用性試驗結果以0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑時，試驗組、供試品對照組及陰性對照組無菌落生長，菌液組有典型菌落生長，表明供試液對控制菌生長有抑制作用。以pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑時，試驗組、菌液組有典型菌落生長，供試品對照組及陰性對照組無菌落生長，表明供試液對控制菌生長無抑制作用。因此，根據《中國藥典》2015年版四部通則1106控制菌檢查要求，宜選用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，并采用常規法用于控制菌檢查。見表6。

表6 控制菌驗證結果(n=3)

3 討 論

3.1 開展本試驗研究的必要性現行的《中國藥典》和《軍隊制劑規范》均無10%水楊酸軟膏微生物限度檢查方法，亦未見相關研究報道，因此進行試驗研究及方法學驗證對保證其質量具有重要意義。

3.2 供試液制備增溶劑的選擇水楊酸軟膏由水楊酸、羊毛脂、黃凡士林等配制而成[1]。水楊酸是一種脂溶性的有機酸[11]，具有部分酸的通性，在水中的溶解性較差，而黃凡士林的熔點為45～60 ℃[12]，具有一定的拉絲性，因此供試液制備時必須遴選適宜的增溶劑。經試驗，我們采取加入10%肉豆蔻酸異丙酯和10%二甲基亞砜置于45 ℃水浴超聲30 min，發現其不但沒有影響微生物生長繁殖，還明顯提高了水楊酸軟膏的溶解性。其中，肉豆蔻酸異丙酯具有良好的溶解、潤滑、促透作用，還具有一定的自乳化作用，而二甲基亞砜具有強極性、脂水雙親性及其在液態所處溫度范圍廣等特性，是兼容有機物和無機物的萬能溶劑，兩者對難溶性或脂溶性藥物具有增溶作用[13-14]。

3.3 供試液pH值對抗菌活性的影響pH值與微生物生長代謝密切相關，不同微生物有不同的適宜pH值，可根據需要調節pH值以適應不同微生物生長需求[15]。對好氧微生物而言，pH值維持在5～9最優。前期我們選用0.9%氯化鈉注射液為稀釋劑時，制備所得1∶10～1∶100供試液pH值在2.30～2.81之間，采用常規法、培養基稀釋法5種試驗菌株的回收率均低于0.5，推測強酸環境是導致試驗菌株不生長的主要原因。后期我們改用具有pH緩沖作用的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，制備所得1∶10～1∶100供試液pH值在5.53～6.88之間，采用常規法5種試驗菌株的回收率均在0.5～2的標準范圍內，而且很好地去除了水楊酸軟膏的抑菌性。

綜上所述，經驗證，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，采用常規法可作為10%水楊酸軟膏的微生物限度檢查方法。