異丙酚對心肌缺血再灌注損傷大鼠模型Toll樣受體4及高遷移率族蛋白1表達的影響

黎真真, 陳飛任, 吳紅發, 鐘有清

(1.海南省海口市婦幼保健院 麻醉科, 海南 海口, 570102;2.海南醫學院第一附屬醫院 呼吸內科, 海南 海口, 570102)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是因多種病因導致的心肌缺血壞死，嚴重者可出現心律失常、心功能障礙等，甚至導致死亡[1]。手術過程中心肌缺血發生率較高，適當應用麻醉劑可發揮心肌保護作用。研究[2-3]發現異丙酚可保護缺血的肝細胞，具有抗氧化功能，可清除MIRI中釋放的自由基。MIRI發生涉及多種細胞因子、信號通路，研究[4]表明，抑制氧自由基、炎癥因子的釋放能顯著減輕心肌缺血再灌注引起的細胞凋亡、壞死。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種炎性因子，在氧化應激等情況下可被釋放入血，與相應的配體結合，擴大炎癥反應及免疫細胞的遷移、分化等[5]。Toll樣受體4(TLR-4)屬于跨膜信號轉導家族蛋白，在免疫功能維持、炎性反應中起到至關重要的作用[6], TLR-4與炎性反應有關，可能參與了MIRI的發生。本研究擬通過建立大鼠MIRI模型，探討異丙酚是否對MIRI起保護作用，并研究該過程中HMGB1、TLR4蛋白的表達變化，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取60只清潔級Wista大鼠，鼠齡18～20周，雌雄不限，體質量340～400 g, 由江蘇省農業科學院實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(蘇)2012-0005, 使用許可證號為SYXK(蘇)2014-0030。動物處理及實驗過程得到海南省人民醫院動物關懷及使用委員會的許可(HNRMYY0012)。實驗研究過程中嚴格遵守3R原則。

1.2 主要儀器及試劑

兔抗鼠HMGB1、TLR4及β-actin單克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體(Sigma公司，美國); TRIzol試劑盒(Invitrogen公司，美國); 逆轉錄、PCR試劑盒(大連寶生物，中國); 蛋白酶K溶液(上海生工技術有限公司，中國); 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)引物(上海生工技術有限公司，中國); 異丙酚(批號090822, 河北九派制藥有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 心肌缺血再灌注大鼠模型的建立及分組: 所有實驗動物在動物房進行適應性飼養1周。60只大鼠隨機分為4組，即假手術組(A組)、假手術聯合異丙酚組(B組)、心肌缺血再灌注組(C組)、心肌缺血再灌注聯合異丙酚組(D組)。A組采用常規戊巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈麻醉，消毒、鋪巾。行氣管插管，連接麻醉機，以混有30%氧氣的空氧混合氣體作為載體氣體，通氣流速(mL/min)=0.65×體質量(g)。開胸，顯露心臟，于左心耳根部2 mm處穿線后，不夾閉左冠狀動脈前降支及心大靜脈, 60 min后縫合。B組手術開始前10 min靜脈泵入異丙酚6 mg/kg至術后60 min。C組麻醉后于胸骨左緣3～4肋間開胸，顯露心臟，于左心耳根部2 mm處用絲線夾閉左冠狀動脈前降支及心大靜脈，使心肌失去血液灌注，持續缺血30 min后，打開夾閉的動脈，再灌注120 min。D組手術開始前10 min靜脈泵入異丙酚 6 mg/kg至術后60 min。

1.3.2 HE染色: 實驗完畢后，解剖出心臟，取心肌組織，制備石蠟切片(4 μm), 二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，切片經蒸餾水洗滌，放入蘇木精溶液染色數分鐘，經酸水及氨水分色，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明后用樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.3 TUNEL法檢測細胞凋亡率: 心肌標本經石蠟切片預處理，脫蠟、水化、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，滴加蛋白酶K溶液100 μL室溫下孵育8 min，PBS洗滌; 在此基礎上滴加抗熒光素體和TUNEL標志液，而后利用PBS沖洗3次, 5 min/次，經緩沖液Ⅲ平衡后，室溫顯色，并滴加氮藍四唑/溴氯吲哚基磷酸鹽顯色及觀察。采用Leica QWin V3電腦圖像分析系統，觀察TUNEL陽性細胞并計數，計算凋亡細胞數占總細胞數的百分比，得到心肌凋亡指數。

1.3.4 RT-PCR法檢測TNF-α和IL-6 mRNA水平: 采用超聲粉碎心肌組織細胞并采用PBS洗滌、溶解，然后根據TRIzol試劑盒提示一步法提取心肌細胞中RNA分子，測定RNA濃度和純度后，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。目標引物序列參照Gene Bank, 由日本Takara公司合成，見表1。采用PCR擴增儀，根據反應要求配置反應體系，包括SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL和上下游引物10 μmol/L各1.0 μL, 加反應水至總體積為25.0 μL。反應參數設置: 95 ℃預退變 5 min, 95 ℃退變 30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃ 30 s共30個循環, 75 ℃讀取熒光，構建溶解曲線。2-△△Ct法計算目標引物mRNA的相對表達量。

表1 目標引物序列和大小

1.3.5 Western Blot檢測HMGB1、TLR4蛋白量表達: 解剖出心肌組織，加2 mL RIPA組織裂解液，勻漿，冰浴30 min, 40 ℃ 500×g離心5 min, 吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μL待測。配膠，上樣，電泳，轉膜，切膜，封閉液封閉1 h, 逐次兔抗鼠HMGB1、TLR4及β-actin單克隆抗體、HRP標記的二抗。Bio-Rad成像儀曝光成像，Image Lab Software測定光密度，結果以目標蛋白與參照蛋白條帶比值表示相對表達量。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理學變化

在光學顯微鏡下, A組心肌組織排列整齊，細胞形態正常; B組心肌結構正常，輕度水腫，少量炎癥細胞浸潤; C組、D組中心肌纖維變形和紊亂，心肌細胞腫脹、破裂以及炎性細胞浸潤。見圖1。

A: A組心肌組織; B: B組心肌組織; C: C組心肌組織，箭頭所指為心肌細胞破裂; D: D組心肌組織。

2.2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較

TUNEL染色表明，凋亡的心肌細胞呈棕褐色。C組心肌凋亡指數為(0.39±0.05)%, 高于A組的(0.01±0.02)%、B組的(0.01±0.03)%、D組的(0.17±0.03)%, 差異有統計學意義(t=15.36、15.44、9.73,P<0.01)。見圖2。

A: A組心肌細胞排列規整，未見凋亡細胞; B: B組心肌細胞核完整，無凋亡細胞;C: C組可見大量凋亡細胞，呈褐色，箭頭所指為凋亡細胞; D: D組可見散在的棕褐色心肌細胞，但較C組少，箭頭所指為凋亡細胞;E: 各組心肌凋亡指數比較。與A組、B組比較, **P<0.01; 與C組比較, ##P<0.01。

2.3 各組TNF-α和IL-6的mRNA水平比較

A組大鼠心肌TNF-α和IL-6的mRNA表達水平與B組比較，差異無統計學意義(P>0.05); C組、D組大鼠心肌TNF-α、IL-6的mRNA表達水平高于A組，差異有統計學意義(t=16.26、8.04、17.66、11.83,P=0.01、0.02、0.01、0.01); D組大鼠心肌TNF-α、IL-6的mRNA表達水平低于C組，差異有統計學意義(t=9.04、8.55,P=0.03、0.04)。見圖3。

A: RT-PCR法檢測各組TNF-α mRNA的表達水平; B: RT-PCR法檢測各組IL-6 mRNA的表達水平;C: 各組TNF-α mRNA的表達水平比較; D: 各組IL-6 mRNA的表達水平比較。

2.4 各組大鼠心肌組織TLR4、HMGB1蛋白表達

A組大鼠心肌TLR4、HMGB1蛋白表達水平與B組比較，差異無統計學意義(P>0.05); C組、D組大鼠心肌TLR4、HMGB1蛋白表達水平高于A組，差異有統計學意義(t=15.87、9.11、11.95、8.73,P<0.01); D組大鼠心肌TLR4、HMGB1蛋白表達水平低于C組，差異有統計學意義(t=10.02、9.83,P=0.03、0.03)。見圖4。

A: Western Blot檢測HMGB1、TLR4蛋白量表達; B: 各組HMGB1、TLR4蛋白定量結果比較。

3 討 論

異丙酚是臨床常用的全身麻醉誘導劑，具有起效快、副作用小等優勢。研究[7]表明，異丙酚在肝、腎、腦等臟器損傷中可發揮保護作用。研究[8]表明，異丙酚可以保護心血管疾病手術患者的心血管系統。研究[9]表明，異丙酚對MIRI犬的心電傳導、心功能、心肌灌注具有保護功能。動物實驗[10]結果提示，異丙酚可抑制心肌纖維收縮，從而減少心肌耗能，同時異丙酚具有抗氧化作用，可維持細胞內線粒體完整性。曹軍濤等[11]研究結果表明，異丙酚可減輕糖尿病大鼠MIRI導致的心肌細胞受損，保護大鼠心臟功能。本研究心肌組織HE染色結果提示，缺血再灌注的心肌細胞排列紊亂，胞漿染色不均勻，細胞核消失，呈空泡，心肌纖維排列松散、無序，肌纖維變性腫脹，間質水腫，紅細胞滲漏，中性粒細胞浸潤，A組大鼠心肌正常，同時發現異丙酚預處理的大鼠心肌損傷較未使用異丙酚大鼠輕，TUNEL染色同樣表明異丙酚可減輕MIRI導致的心肌損害。

研究[12]表明，炎性反應在MIRI中發揮重要的作用。TNF-α、IL-6是參與MIRI的重要炎性介質。TNF-α為促炎因子，由心肌巨噬細胞和心肌細胞分泌[13]; TNF-α可抑制心肌細胞葡萄糖轉運蛋白的表達，導致心肌細胞對葡萄糖的利用障礙。TNF-α還可以誘導IL-1、IL-6等大量合成，并通過一系列的通道，正反饋引起TNF-α的合成，擴大炎癥反應[14]。

HMGB1屬于核蛋白家族，當細胞出現損傷、壞死或機體在炎性反應的刺激下巨噬細胞釋放入血，與免疫細胞膜上的受體結合，引起炎癥因子(TNF-α、IL-6)的分泌以及免疫細胞的遷移、分化等[15]。研究[16]表明, MIRI大鼠血清HMGB1含量明顯高于正常大鼠，靜脈滴注抗HMGB1抗體后可減輕心肌細胞損害。研究[17]提示, HMGB1預處理能減輕心肌MIRI程度，縮小心肌壞死范圍。TLR-4屬于跨膜信號轉導家族蛋白，在免疫功能維持、炎性反應中發揮重要的作用[18], TLR-4可能也參與了HMGB1信號轉導。研究[19]表明，使用HMGB1抑制劑后，細胞可通過抑制TLR4/NF-κB通道蛋白減輕壞死性小腸結腸炎的癥狀。研究[20]提示維達立肽可通過TLR4/NF-κB/HMGB1通路保護缺血再灌注損傷的肝臟。研究[21]認為，HMGB1可結合糖基化終產物受體(RAGE), 進而促進TLR4和炎癥因子的分泌，而TLR4又可促進HMGB1分泌。上述結果表明，HMGB1可通過TLR4信號通路促進炎性反應，參與細胞缺血再灌注損傷。

本研究結果表明，MIRI組大鼠心肌的TLR4、HMGB1、TNF-α、IL-6較正常大鼠顯著升高，而異丙酚預處理后的大鼠心肌TLR4、HMGB1、TNF-α、IL-6的表達水平顯著降低，表明靜脈注射異丙酚可保護缺血再灌注損傷的心肌，可能與異丙酚清除細胞產生的氧自由基、抑制HMGB1/TLR4通道的活性、降低炎性介質TNF-α、IL-6的表達以及減輕炎性反應有關。

綜上所述，異丙酚能顯著減輕MIRI大鼠的心肌細胞凋亡和炎癥反應，其機制可能與異丙酚抑制HMGB1、LR4蛋白活性和減少炎性因子的釋放有關。