微小核糖核酸與骨不連

黃麗麗，章海軍，何 悅，黃嘉琛，劉 源，胡 軍

(1.南京醫科大學第一附屬醫院感染病科,南京 210029；2.南京醫科大學第一附屬醫院骨科,南京 210029)

骨不連是長骨骨折后較為常見的一種并發癥，通常被定義為骨折超過9個月仍未愈合，并已連續3個月沒有任何愈合跡象[1],盡管大多數骨折都能夠實現正常愈合，但仍5%～10%會發生骨不連[2]。由于骨不連發生率較高，且治療難度大，一直是國內外臨床醫師面臨的難點和挑戰。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類內生性非編碼小分子RNA，可在轉錄后水平上調控基因表達，在細胞增殖、分化、凋亡等過程中發揮著重要作用[3]。近來研究發現，多種miRNA可以調節特定靶基因的表達而對骨不連發生發展過程中炎癥反應、血管生成、成骨細胞分化及遷移等過程產生影響。但目前為止，未有對miRNA和骨不連之間的具體作用機制進行詳細分析總結，因此，本文就兩者之間的相關性作一綜述，這為研究骨不連的發生發展提供了理論依據，為骨不連的診斷和治療提供新的方向。

1 miRNA的生物學特征

miRNA是一類內生性非編碼小分子RNA，長18～22個核苷酸，并且在整個進化過程中高度保守，可以調控基因的表達[4]，是眾多生物過程的調控因子，包括發育、增殖、凋亡和細胞代謝等[5]。異常的miRNA表達會改變細胞內的翻譯環境，導致有害的表型結果或疾病狀態[6]。目前研究已經表明miRNA的異常表達與多種骨科疾病之間關系密切。Wang等[7]發現miR-21-5p在骨關節炎患者軟骨組織中表達上調，且在骨關節炎小鼠模型中進行關節內注射miR-21-5p拮抗劑后可以顯著減輕關節軟骨退化，從而改善骨關節炎。在骨骼生物學領域，miRNA有助于調節成骨細胞和破骨細胞的分化和功能，在骨折中發揮重要作用[8]。最近一項研究表明成骨細胞中的miR-29a可以通過抑制破骨細胞調節因子核因子κB受體活化因子配體和CXC型趨化因子配體12來減少破骨細胞分化，從而減少骨質疏松對人體的傷害[9]。骨不連的發生發展過程中，伴隨著多種信號通路的激活，如核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路、Wnt/β-catenin信號通路，這些信號通路中的轉錄因子如NF-κB、淋巴增強因子1等可以通過促進相關miRNA的轉錄從而使相關miRNA表達增加，進而調節骨不連中的炎癥反應和骨骼生長等過程[10-11]。近年來，多項研究發現miRNA可以調節特定靶基因的表達而對骨不連發生發展過程中炎癥反應、血管生成、成骨細胞分化及遷移等過程產生影響，下面就其在骨不連中具體作用機制作詳細描述。

2 miRNA在骨不連中的作用

2.1miRNA在骨不連炎癥反應中的作用 在骨折愈合早期，骨折部位出現炎癥細胞浸潤及炎癥因子釋放，釋放的炎癥因子可以促進間充質干細胞的募集、刺激成骨細胞及破骨細胞等。miRNA可以通過作用于骨折愈合過程中的炎癥反應來影響骨不連的發生發展。一項研究在患有糖尿病的大鼠閉合性橫向骨折模型中發現miR-181a-1-3p可以直接通過靶向降低IL-1α的表達，導致骨折愈合過程中正常炎癥反應的失調，從而導致骨折愈合受損，甚至愈合延遲和骨不連[12]。Gerstenfeld等[13]發現在TNF-α受體基因敲除的脛骨骨干閉合性骨折小鼠中骨折愈合會嚴重受損，并產生膜內和軟骨內骨化延遲。而Waki等[14]通過一系列通過灼燒骨折部位骨膜構建的大鼠骨不連模型的研究中發現miR-140-3p的表達比正常骨折愈合組的有明顯改變，miR-140-3p可以通過靶向作用于NF-κB的共激活劑核受體輔激活蛋白1和核受體相互作用蛋白1，從而負性調節NF-κB的表達。而激活的NF-κB可作為TNF-α信號通路的重要反應分子，說明miR-140-3p對骨不連的炎癥反應中的炎癥因子起到負性調節作用[15]。另一項通過股骨截骨所致的骨不連小鼠中也發現miR-140-3p的升高，且也是作用于NF-κB來抑制炎癥反應從而導致骨折愈合受損[16]。此外，Waki等[14]研究還發現miR-181a-5p和miR-451a在骨不連組表達增高，而這三種miRNA均已被證實參與調節炎癥反應[17-19]，miR-181a-5p可以通過直接靶向降低IL-1α水平調節炎癥反應，miR-451a則通過作用于14-3-3ζ和RAS癌基因家族成員Rab5a來抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的表達。在炎癥信號通路中，炎癥因子TNF-α和IL-1α可以激活MAPK的表達，MAPK通路的激活也會促進這些炎癥因子的生成，這些結果都提示miR-451a和miR-181a-5p在骨不連的炎癥因子的產生起調節作用[15]。也有研究發現骨不連大鼠的miR-31a-5p,miR-146a-5p,miR-146b-5p和miR-223-3p的表達與正常愈合大鼠之間存在差異[20]。這些miRNA都參與調節機體的炎癥反應，抑制miR-31a-5p的表達可通過Wnt/β-catenin信號通路來降低熱應激下人真皮成纖維細胞的炎癥反應并提高其細胞存活率[21]，miR-146a-5p可以抑制促炎因子IL-1β、IL-6的表達[22]，而阻斷miR-146b-5p會增加動脈粥樣硬化相關泡沫細胞形成中的炎癥反應[23]，miR-223-3p可以靶向作用信號轉導和轉錄激活因子3來負性調節IL-1和IL-6的表達[24]。

2.2miRNA在骨不連骨骼生長中的作用 成骨、軟骨形成和血管生成是骨折愈合修復階段的主要過程。成骨細胞和軟骨細胞增殖及分化功能受損，或血管形成異常均會導致骨折愈合障礙甚至不愈合[25]。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是轉化因子超家族的成員，可以通過刺激細胞增殖、分化和趨化、細胞黏附以及血管形成來刺激新生骨形成，增加新生骨痂的力學強度，從而促進骨折愈合[26]。相關研究表明miR-140-5p可以抑制未分化的人間充質干細胞的成骨作用，且可調節人脂肪干細胞的成脂和成骨平衡[27]，而BMP-2已被證實是miR-140-5p作用靶點[28]。Takahara等[12]在大鼠股骨閉合性橫斷骨折模型研究中發現miR-140-5p可以通過作用于靶基因天冬酰氨肽酶來抑制BMP信號通路，從而使骨折愈合中的成骨，軟骨形成和軟骨內骨化過程受損，導致骨不連。Waki等[14]在灼燒骨折部位骨膜形成骨不連的大鼠中也發現miR-140-5p表達明顯下降。miRNA除了作用于BMP-2，最近一項研究發現抑制miR-342-5p可以通過上調BMP-7的表達，激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶信號傳導通路，從而促進成骨細胞的增殖、分化和遷移[29]，在骨不連發病機制中起重要作用。

Wnt/β-catenin信號通路在成骨分化中促進細胞增殖和礦化、阻止細胞凋亡，還可促進間充質祖細胞向成骨細胞的分化，在骨折愈合中發揮著重要作用[30]。Pannexin間隙連接蛋白3(pannexin gap junction protein family member 3，PANX3)是由軟骨細胞和成骨細胞的增殖和分化誘導而來[31]，Jia和Zhou[32]開展一項研究發現下調miR-367的表達則會通過激活PANX3介導的Wnt/β-catenin途徑促進成骨細胞在骨折過程中的生長和增殖，說明miRNA可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來影響骨折愈合甚至骨不連。此外，有研究表明miR-381在萎縮性骨不連形成過程中通過與Wnt5a和卷曲同源物3的3’端非編碼區結合，調節β-catenin的核轉位，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路，調節人骨髓間充質干細胞的成骨作用[33]。同樣，miRNA也可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路來調節骨不連的骨骼生長。Sun等[34]研究表明將miR-26a模擬物注射入骨不連大鼠中后引起miR-26a過表達，可以觀察到骨鈣素和堿性磷酸酶表達增加，表明促進了骨折的愈合，進一步研究發現硬化蛋白結構域蛋白1(sclerostin domain-containing1，SOSTDC1)可以負性調節Wnt/β-catenin信號通路，且SOSTDC1已被證實可以抑制骨折愈合。他們進一步推測miR-26a可能通過靶向抑制SOSTDC1的表達從而進一步激活Wnt/β-catenin信號通路，增強間充質干細胞的成骨分化，進而實現其對促進骨不連大鼠骨折愈合的作用。

2.3miRNA在骨不連血管生成中的作用 充分且穩定的血液供應對于骨折愈合至關重要，如果骨折愈合過程中血管生成不佳，導致骨折愈合延遲甚至骨不連。miR-210-3p在低氧后的反應性血管生成中發揮著關鍵作用，其過表達后可以增強毛細血管樣結構的形成和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)驅動的內皮細胞遷移。miR-210-3p在低氧狀態下的相關靶向作用點是促紅細胞生成素肝細胞受體配體A3(erythropoietin-producing hepatocellular receptor ligand-A3，Ephrin-A3)，Ephrin-A3可以通過VEGF途徑控制的Eph-Ephrin系統，調節血管生成[35]，有研究證明通過關節內注射雙鏈miR-210-3p可以增加血管生成從而促進大鼠前交叉韌帶部分撕裂的愈合[36]。Takahara等[12]對大鼠閉合性股骨干橫行骨折研究后表明miR-210-3p在骨折愈合后期表達下降可能會抑制骨折愈合過程中正常血管生成，從而導致骨折愈合不良甚至骨不連。同時，他們還發現miR-222-3p在骨折愈合早期表達增高時可以抑制血管生成，影響骨折愈合。miR-222-3p可以通過直接抑制干細胞生長因子受體的表達來減少細胞存活、遷移，從而抑制血管形成，使骨折愈合延遲甚至發生骨不連。

3 miRNA作為骨不連診斷和治療的新靶點

目前骨不連的診斷主要依靠影像學檢查，其中X線片和CT是臨床上運用最廣泛的診斷方法，但亦存在一定的局限性，如營養不良性骨不連較難在早期通過影像學檢查明確診斷。同時，感染性骨不連由于微生物培養陽性率低，且非特性炎性指標診斷效能低，急需一種更具優勢的診斷指標來診斷[37]。臨床上檢測miRNA的方法主要有實時熒光定量PCR技術(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)、熒光原位雜交技術、miRNA芯片技術等。Romeo等[38]使用qRT-PCR檢測血漿中miR-375的表達，發現miR-375升高是晚期甲狀腺髓樣癌患者預后不良的可靠檢測指標。而Renwick等[39]研究使用熒光原位雜交技術對腫瘤活檢組織中miRNA進行檢測，用于鑒別皮膚基底細胞癌和梅克爾細胞癌。此外，Duan等[40]利用miRNA芯片技術篩選出在阿霉素耐藥的骨肉瘤中表達明顯改變的miRNA，進一步研究發現上調miR-15b的表達可以改善骨肉瘤化療耐藥。關于miRNA成本，Charytonowicz等[41]的研究通過對睪丸惡性生殖細胞腫瘤術后或化療后疾病監測的成本分析發現，miRNA檢測對比于CT檢查作為復查指標可使10年內的復查成本減少約8 560美元，相對節省約44%預期成本。說明miRNA檢測具有臨床經濟實用性，提示使用miRNA作為疾病監測的生物標志物前景廣闊。miRNA作為調節體內基因表達的重要分子，與骨不連中的炎癥反應、骨形成與軟骨形成、血管生成等均證實存在聯系。Scimeca和Verron[42]關于miRNA如何運用于骨折愈合領域提出了3條建議：(1)確定靶標miRNA并決定是否增加或降低其表達；(2)設計如何替代miRNA或抑制其表達；(3)使用特定運輸方法來遞送miRNA，并考慮其類型、轉染效率和特異性。這些都為今后如何將miRNA應用于骨不連診斷和治療提供新的思路。

目前臨床上對于骨不連的治療仍以手術治療為主，如髓內釘內固定術、自體骨移植術等，此外一些促進骨折愈合的生長因子如骨形成蛋白、硬化分子等也被用于骨不連的治療，基于miRNA的骨不連治療目前仍處于實驗室研究階段，Zhang等[43]研究使用一種幾乎無細胞毒性的超支化聚合物用于結合miRNA，并用可生物降解的微球對兩者進行包裹，微球連接到無細胞的納米纖維聚合物支架上，該支架可在空間上控制miR-26a的釋放。這項技術通過控制miR-26a靶向作用于糖原合成酶激酶-3β進而激活內源性干細胞的成骨細胞活性，用于治療小鼠顱骨臨界性骨缺損，但miRNA用于臨床治療骨不連的相關報道仍然較少，需要進一步研究。

4 總結和展望

作為骨折常見的一種并發癥，骨不連會造成患者長期行動不便和慢性疼痛，甚至導致再次手術、生活質量嚴重下降、無法正常工作。本篇綜述初步介紹miRNA與骨不連之間的聯系，闡述這些miRNA在骨不連中分子作用機制，可為骨不連臨床診斷的生化標志物、基因治療的靶向藥物設計等方面研究提供新的思路。目前骨不連的診斷和治療仍存在一定的難點和挑戰，然而隨著基于miRNA的骨骼生物學研究的不斷深入，有望在加速骨折愈合，提高難治性骨不連救治成功率及改善骨折患者預后等方面逐漸取得一定的突破。