生物標志物聯合創傷評分對創傷后膿毒癥的診斷價值

阿米娜·阿不列孜，阿合買提江·帕哈丁，黃揚眉，朱功兵

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院急救創傷中心，烏魯木齊 830000;2.重慶市急救醫療中心，重慶 400014)

每年我國因創傷就醫者高達6 200萬，其中致死人數70～80萬，是45歲以下人群的首要致死原因[1]。嚴重創傷會導致機體與外界環境直接接觸的屏障損傷，增加病原菌入侵的機會，使機體發生感染[2]，從而破壞免疫系統的平衡與穩態，導致免疫抑制，并極易并發膿毒癥，最終發展為不可逆的多器官功能衰竭[3-4]。膿毒癥成為嚴重創傷后常見并嚴重的并發癥，創傷引起膿毒癥的病死率17%～23%[5]。早期快速準確的預測診斷和治療成為降低膿毒癥發病率和病死率的關鍵[6]。由于創傷后膿毒癥發病機制復雜多樣且存在個體差異，精確定時的檢測是一項艱巨的挑戰。膿毒癥生物標志物可以幫助預測膿毒癥的診斷和預后，并監測治療反應，但單一的生物標志物難以實現有效診斷及預測，因此可能需要多種生物標志物聯合檢測協助實現創傷后膿毒癥的早發現、早治療。

近年來，關于創傷后膿毒癥預警標志物的基因及分子等層面的相關研究逐漸增多，包括巨噬細胞遷移抑制因子、硫氧還蛋白、可溶性CD14亞型、微小核糖核酸等[7-8]。膿毒癥診斷不僅僅基于實驗室檢測，新的臨床研究表明，膿毒癥新的定義和損傷嚴重程度評分(ISS)對膿毒癥的早期識別和診斷具有重要意義[9]。多種生物標志物聯合檢測是創傷后膿毒癥研究的一個新方向，也是近年來研究的熱點。由于各種生物標志物在診斷及預測創傷患者預后方面存在局限性，本研究前瞻性研究2019年12月—2020年6月新疆醫科大學第一附屬醫院急救創傷中心收治嚴重創傷患者196例，通過ISS及血液學檢查指標聯合對創傷患者發展為膿毒癥及預后進行預測，探討評估創傷患者病情危重程度及預后的新思路。

資料與方法

1 一般資料

納入標準：年齡≥18歲；ISS≥16分；入院后新發出現膿毒癥。排除標準：免疫系統缺陷疾病；妊娠及哺乳期婦女；有血液系統疾病和(或)長期使用糖皮質激素；創傷時間超過24h后住院或轉院。參照2016年第三次國際膿毒癥及膿毒性休克治療指南定義的膿毒癥診斷標準[10]：機體對感染反應失調導致的危及生命的器官功能障礙。發病以遠離感染部位的器官功能障礙開始為特征。可疑感染患者+序慣性器官衰竭評分(sequential organ failure assessment score,SOFA)增加2分。

本組收治嚴重創傷患者196例，男性129例，女性67例；年齡20～94歲，平均49.7歲。致傷原因包括物理性(機械力、高熱、電擊)，化學性(如強酸、強堿及糜爛性毒劑)等。根據膿毒癥診斷標準將患者分為膿毒癥組(61例)和非膿毒癥組(135例)，并根據預后結果將膿毒癥組分為死亡組(26例)和存活組(35例)。本研究經醫院醫學倫理委員會批準(K202103-08)。

2 研究方法

收集研究對象基本信息，包括性別、年齡、主診斷、住院時間、ISS、入院時及病情變化時的SOFA及轉歸情況。創傷患者入院后10min內完成ISS，并在24h內嚴密監測ISS≥16分的患者，結合病情及其相關重要臟器功能指標持續上升考慮患者此時已有膿毒癥高風險。

本研究選取24h內監測此次研究所選擇的各項指標，以盡早預防膿毒癥發生為目的，并判斷各生物標志物在膿毒癥發生之前早期的潛在預測價值。患者入院24h內抽取外周血標本并檢測T細胞亞群項目(主要包括CD4、CD8、CD4/CD8)、降鈣素原(PCT)、白介素-6(IL-6)、乳酸、中性粒細胞、淋巴細胞等。CD4、CD8、CD4/CD8檢測采用流式細胞法，使用BD FACS calibur流式細胞儀；PCT、IL-6采用電化學發光法檢測，使用羅氏cobas E411電化學發光免疫分析儀；乳酸檢測使用強生VITROS 5600全自動生化免疫分析儀；中性粒細胞及淋巴細胞使用希森美康XE5000全自動五分類血細胞分析儀檢測。

3 統計學分析

結 果

膿毒癥組與非膿毒癥組以及死亡組與存活組中，CD4、CD8、CD4/CD8、PCT、IL-6、乳酸、ISS比較差異均有統計學意義(P<0.05)。而年齡僅在死亡組與存活組間有統計學意義(P<0.05)。男性患者在各組占比均高于50%。年齡在膿毒癥組與非膿毒癥組患者中差異無統計學意義，淋巴細胞及中性粒細胞死亡組與存活組患者比較差異無統計學意義(P>0.05)。

CD8、ISS、PCT、IL-6、乳酸及中性粒細胞數平均水平在膿毒癥組和死亡組中均比非膿毒癥及存活組高，而CD4、CD4/CD8水平在膿毒癥組和死亡組中比非膿毒癥組和存活組低，而這種變化在死亡組中較膿毒癥組更顯著。見表1、2。

表1 創傷后膿毒癥組與非膿毒癥組患者基本情況比較

組別IL-6(pg/L)乳酸(mmol/L)淋巴細胞(×109/L)中性粒細胞(×109/L)膿毒癥組(n=61)369.04±106.813.10±2.421.00±0.5311.95±4.90非膿毒癥組(n=135)59.62±77.882.06±1.041.44±0.788.54±4.33檢驗值Z-5.608-3.054-4.065-5.136P值<0.0010.002<0.001<0.001

表2 創傷后膿毒癥死亡組與存活組基本情況比較

組別IL-6(pg/L)乳酸(mmol/L)淋巴細胞(×109/L)中性粒細胞(×109/L)死亡組(n=26)661.79±213.094.09±3.181.09±0.5515.61±4.65存活組(n=35)151.58±136.432.36±1.070.93±0.7615.30±4.66檢驗值Z值-2.997-2.007-1.240-0.254P值0.0030.0450.2150.081

對膿毒癥組與非膿毒癥組，死亡組與存活組均有統計學意義的7項指標，即CD4、CD8、CD4/CD8、PCT、IL-6、乳酸、ISS進行Logistic回歸單因素分析，結果顯示上述7項指標均與創傷后膿毒癥有關(P<0.05或P<0.01)。見表3。再進行多因素Logistic回歸分析以確定診斷膿毒癥的獨立因素，分析結果CD4/CD8及ISS是診斷創傷后膿毒癥獨立影響因素(P<0.01)，CD4/CD8值越低，ISS評分越高，患膿毒癥的可能性越大。見表4。

表3 單因素Logistic回歸對創傷患者診斷膿毒癥的分析

表4 多因素Logistic回歸對創傷患者診斷膿毒癥的分析

經統計分析可知ISS在各生物標志物單獨診斷創傷后膿毒癥時的效能最高，ROC曲線下面積AUC 0.866，靈敏度77.05%，特異度80.74%，這可能與此研究中研究對象均為嚴重創傷患者有關；其次CD4/CD8(AUC=0.847)，其靈敏度65.57%，特異度87.41%；第三位PCT(AUC=0.840)，靈敏度72.13%，特異度81.48%。而IL-6及乳酸的診斷效能遠不及其他生物標志物，其AUC、靈敏度均低于其他生物標志物。筆者從創傷后膿毒癥發生發展機制的不同方面選取PCT、ISS及CD4/CD8形成新的組合，檢測其聯合診斷的效能，ROC曲線下面積AUC=0.927，靈敏度91.80%，特異度81.48%，高于任何生物標志物及評分單獨使用時的AUC，且對早期診斷重要的靈敏度及陰性預測值也比單獨使用時有明顯提高。見表5、圖1。

圖1 CD4/CD8，PCT，ISS組合和各生物標志物單獨診斷膿毒癥的ROC曲線

表5 各項生物標志物及評分單獨與聯合診斷創傷后膿毒癥的診斷效能比較

通過多因素Logistic回歸分析創傷后膿毒癥死亡患者26例的預后影響因素，結果提示ISS為創傷后膿毒癥患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)。其OR值0.199，95%CI為1.015～1.466，反映ISS越高，創傷患者死亡風險越大。見表6。

表6 多因素Logistic回歸對創傷性膿毒癥患者死亡的分析

討 論

嚴重創傷患者初始復蘇后因創傷后并發癥在院內病死率較高，因為創傷后誘發的早期急性應激及隨之而來的炎癥反應和免疫異常等事件的進行性發展，最終導致不可逆的器官衰竭直至死亡，因此快速、準確、有效地診斷創傷后膿毒癥對改善病情及預后有著非常重要的作用。

創傷患者對膿毒癥易感性最重要的特征之一是免疫平衡紊亂導致持續的免疫抑制[11]。膿毒癥復雜的免疫學改變領域的新研究表明，持續的免疫抑制是膿毒癥高病死率的關鍵決定因素。其免疫抑制特點是T細胞分化和功能障礙，循環中CD4+T淋巴細胞數量的減少及其向Th2表型的轉變為特征的獲得性免疫系統抑制并伴有先天性免疫系統激活[12-14]。一旦設法獲得創傷后的免疫抑制和免疫刺激過程的詳細特征，以及能夠區分患者免疫狀態的特定生物標志物，就意味著可以結合創傷后膿毒癥患者的免疫狀態以及創傷程度的個體差異來進行個體化治療[13]。T淋巴細胞被認為是宿主對膿毒癥反應的有效早期介體，在先天及獲得性免疫中扮演重要的角色[14]。它們在創傷后炎癥反應中發揮著重要但尚未具有深刻特征的作用，因此可能也是創傷后免疫抑制程度的重要決定因素[15]。T淋巴細胞從骨髓源性前體在胸腺里表達CD4和CD8受體從而達到成熟狀態。CD4+T細胞分化為效應T輔助細胞，CD8+T細胞分化為細胞毒性T細胞，其中輔助型T淋巴細胞在T淋巴細胞中數量最多且作用關鍵，代表著機體特異性免疫系統功能狀態，其數量減少代表機體的細胞免疫受到損害。因此，機體CD4和CD8T淋巴細胞數量的平衡和紊亂也代表機體免疫功能的平衡和紊亂[16-17]。本研究中，各組之間CD4、CD8及其比值均有統計學意義(P<0.05)，且膿毒癥組較非膿毒癥組，死亡組較存活組CD4/CD8比值下降更顯著，表明T淋巴細胞亞群可敏感反映膿毒癥的嚴重程度。研究發現，在多微生物膿毒癥模型中，CD4+T淋巴細胞尤其容易凋亡[9，18]，又有研究表示，CD4+T淋巴細胞百分率和CD4/CD8比值在膿毒癥患者中顯著降低[19]，這與本研究結果相符。并且CD4/CD8比值的下降在創傷后患膿毒癥的多因素回歸分析中成為獨立危險因素，提示著CD4/CD8代表的細胞免疫狀況值相對更加準確地反映患者的預后。ROC曲線分析發現CD4/CD8診斷膿毒血癥的ROC曲線下面積顯著高于IL-6、乳酸，與PCT相近，亦說明CD4/CD8在診斷、評估膿毒癥的預后方面具有一定優勢。

PCT是降鈣素的肽前體,由甲狀旁腺細胞以及肺和腸內的神經內分泌細胞分泌，是機體對如膿毒癥引起的組織損傷和壞死所產生的鈣外流引起的高鈣血癥產生反應[20]。當細菌感染特別是全身感染時顯著升高。監測PCT水平有助于創傷后膿毒癥的早期診斷、評估嚴重程度、指導抗生素治療、判斷預后結果,其臨床意義已經得到了廣泛的認可和應用[21-22]。但嚴重創傷、外科術后等患者早期血清PCT等指標也會顯著升高，因此，應將PCT與至少一種其他生物標記物聯合使用，以避免對膿毒癥診斷尚未確定的患者進行生存或死亡的錯誤假設[23]。本研究中，膿毒癥組與死亡組的PCT水平較各自的對照組顯著升高，表明PCT對于嚴重創傷后膿毒癥的預后作用較好。ROC曲線比較診斷效能中，PCT在曲線下面積較高(AUC=0.840),并且有較好的靈敏度及特異度，對創傷后膿毒癥診斷有一定價值。

ISS可間接量化大量軟組織損傷的創傷患者并可用于定義創傷的嚴重程度，評估住院死亡的風險，以及多發傷患者發生嚴重感染的風險[24]。但ISS也存在較大局限性，因ISS以解剖部位為基礎，對患者傷后的生理功能紊亂狀況并未反映。由于每名患者對創傷的承受能力及治療的反應性存在個體差異，臨床表現也呈現多樣性，患者解剖部位損傷嚴重程度與其創傷后病理生理改變狀況并不一致[25]。本研究中，ISS在各組中的差異同樣均有統計學意義(P<0.05)，Logistic回歸分析提示患膿毒癥及發展為死亡的獨立危險因素，ISS越高，患膿毒癥及死亡的風險越高，這與國內外研究相符[26-27]。據報道，創傷后患者膿毒癥的總發病率2%～10%[28]。在筆者的研究中，膿毒癥的發生率31.1%，可能反映較高的損傷嚴重程度，平均ISS(37.44±14.93)分。這些發現與Gouel-Chéron等[29]描述的比率相似，其隊列研究中創傷后膿毒癥的發生率37%，平均ISS(37±10)分。本研究中ISS診斷膿毒癥截斷值>24分，死亡組平均值(46.58±13.45)分。結合回歸分析結果，認為ISS>24分的創傷患者更容易發展成為膿毒癥，且評分越高，創傷后膿毒癥的結局越傾向于死亡。對于ISS<16分的輕中度創傷患者也有可能會發生膿毒癥，但因時間及人員等有限原因，無法追溯這些患者的預后。

除了創傷性損傷(“第一次打擊”)之外，第二次打擊(如手術、輸血或感染)都可能影響全身生物標志物的濃度。此外，損傷嚴重程度及分布，甚至患者的特定因素，如性別和年齡、創傷前藥物治療、肥胖、先前存在的慢性疾病或酗酒都可能影響創傷后各項指標的濃度。故使用單一的標記物來預測并發癥或決定具體的治療策略是不夠可靠的[30]。ROC曲線分析發現，CD4/CD8、PCT與ISS聯合診斷的診斷效能較任何單項指標診斷創傷后膿毒癥的準確性高。可能的原因是不同指標在膿毒癥的發生發展過程中有著不同或互補的機制：CD4/CD8代表創傷患者的免疫狀態，PCT代表著是否有細菌感染，而ISS提示創傷嚴重程度，若聯合評估各類指標，診斷的敏感性和特異性會相應增加。雖然這三種指標與評分的組合還沒有被使用過，但是每一種生物標志物都已經在其他組合測試中應用。在聯合使用在同一測試時，這三種生物標志物及評分可能提高其診斷和預后的準確性。

本研究仍存在一些不足之處。首先，本研究為單中心研究，樣本量相對較小，研究結果難免存在一定偏移；其次，本研究為橫斷面研究，未能描述各生物標志物的動態變化。如果能夠分析患者CD4、CD8、PCT等的動態變化與療效及預后的關系，可能會更有利于指導臨床的治療。

綜上所述，本研究包括的創傷患者中，ISS、CD4/CD8、PCT等均與患膿毒癥及病情嚴重程度有關。CD4/CD8、PCT與ISS聯合診斷能有效地早期診斷膿毒癥，ISS及CD4/CD8為創傷后膿毒癥獨立影響因素，可以有效評估患者預后。