甲胎蛋白異質(zhì)體在肝臟疾病診斷及預(yù)后價(jià)值中的研究進(jìn)展*

王 娟 綜述，賀琤雯 審校

1．海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200433；2．南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)2016級(jí)，廣東廣州 510515

原發(fā)性肝癌(PLC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，它是因肝內(nèi)膽管細(xì)胞或肝細(xì)胞變異或受到致病菌侵襲導(dǎo)致的惡性腫瘤，具有較高的病死率。早期診斷與治療是延長(zhǎng)患者生存周期，提高治療效果的關(guān)鍵。甲胎蛋白(AFP)異質(zhì)體AFP-L3是《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》推薦的PLC診斷指標(biāo)，它具有靈敏度高和特異度高等特點(diǎn)[1]。作為肝癌細(xì)胞特異性生成的AFP亞型，它與癌細(xì)胞增殖程度密切相關(guān)，并在肝臟疾病的早期診斷及預(yù)后評(píng)估中起重要作用[2-3]。鑒于AFP異質(zhì)體在肝臟疾病中的重要作用，筆者對(duì)AFP異質(zhì)體的檢測(cè)方法及其與肝臟疾病診斷、預(yù)后的關(guān)系等方面進(jìn)行了綜述。

1 AFP異質(zhì)體的分類

AFP是一種含有兩條復(fù)合糖鏈的胚源性糖蛋白，60年代起就作為肝臟惡性腫瘤的標(biāo)志物。由于來(lái)源的不同，其分子在糖鏈結(jié)構(gòu)的亞結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)也不同，由此衍生出AFP變異體，也稱AFP異質(zhì)體。OKUYAMA等[4]根據(jù)AFP與外源性凝集素結(jié)合能力的差異，采用扁豆凝集素(LCA)親和雙向放射免疫電泳法，將人體血清AFP分成LCA結(jié)合型和LCA非結(jié)合型兩種類型異質(zhì)體。從陰極開始在LCA親和電泳上AFP的條帶依次是L1、L2、L3，分別命名為AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。其中AFP-L1主要存在于慢性肝炎和肝硬化患者血清中，構(gòu)成非惡性肝病AFP的主要部分；AFP-L2主要來(lái)自卵黃囊腫瘤，懷孕期間母體內(nèi)可檢測(cè)到；AFP-L3是一種異常糖基化AFP，為肝癌細(xì)胞特異性產(chǎn)生[5-6]。前兩者為L(zhǎng)CA非結(jié)合型，后者為L(zhǎng)CA結(jié)合型，目前人們通常所說(shuō)的AFP異質(zhì)體實(shí)際是指與LCA結(jié)合的AFP-L3[7]。

2 AFP異質(zhì)體檢測(cè)技術(shù)

2.1親和免疫交叉電泳法 親和免疫交叉電泳是檢測(cè)AFP異質(zhì)體的傳統(tǒng)方法，具體是將LCA和瓊脂糖均勻混合制成凝膠板，血清點(diǎn)樣后進(jìn)行電泳。根據(jù)其分子量大小，與LCA結(jié)合的糖蛋白電泳速度降低，以此與非結(jié)合型分離。然后再做垂直免疫電泳，AFP異質(zhì)體與抗AFP抗體結(jié)合形成沉淀峰，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法、放射自顯影法或酶標(biāo)法等顯色技術(shù)顯色后進(jìn)行定量測(cè)定[8]。此方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但干擾因素較多，顯帶圖像不夠清晰，靈敏度較低，故臨床目前較少采用此方法進(jìn)行AFP-L3的檢測(cè)。

2.2親和吸附法 親和吸附法采用親和吸附離心柱，柱內(nèi)裝有耦聯(lián)了LCA的瓊脂糖作為親和介質(zhì)[9]。以液相競(jìng)爭(zhēng)為基礎(chǔ)，在原有AFP測(cè)定的基礎(chǔ)上增加一個(gè)親和吸附的前處理步驟，當(dāng)血清通過(guò)離心柱時(shí)，與LCA結(jié)合力強(qiáng)的留在柱中，經(jīng)過(guò)清洗液除去未結(jié)合的AFP亞型，最后浸泡洗脫得到較純的結(jié)合型AFP-L3。AFP-L3及總的AFP可用化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)。目前臨床采用商品化的微量離心柱法試劑，可以快速、簡(jiǎn)便地獲得標(biāo)本中的AFP-L3成分，然后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行定量檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單，結(jié)果較為準(zhǔn)確，成本較低，是目前臨床常用方法。

2.3AFP-L3蛋白芯片 該方法將鼠源AFP單克隆抗體和小LCA點(diǎn)樣固定在醛基玻片上，制備出AFP抗體和小LCA蛋白芯片，并對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，最后利用化學(xué)發(fā)光方法獲得各個(gè)待測(cè)標(biāo)本的化學(xué)發(fā)光像素值。該蛋白芯片檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了在同一檢測(cè)窗內(nèi)，通過(guò)一次血清標(biāo)本加樣，同時(shí)檢測(cè)AFP和AFP-L3。該方法兼有方便省時(shí)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用兩大優(yōu)勢(shì)，未來(lái)可應(yīng)用于進(jìn)行大規(guī)模的肝細(xì)胞癌(HCC)篩查檢測(cè)，也為未來(lái)多種腫瘤標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)提供了可參考的新途徑。

2.4全自動(dòng)電泳熒光免疫分析法 隨著自動(dòng)化儀器的普及，全自動(dòng)免疫分析儀在臨床得到廣泛應(yīng)用。該方法通過(guò)使用免疫熒光法在液相中進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)后，分離并檢測(cè)形成的免疫復(fù)合物，通過(guò)計(jì)算各組分熒光強(qiáng)度的峰面積，得到AFP-L3的比值。試劑由測(cè)定對(duì)象物質(zhì)中具有親和性的抗原、抗體、受體等加上陰離子構(gòu)成。測(cè)定程序大體分為5個(gè)步驟：(1)形成陰離子結(jié)合物(結(jié)合了DNA的標(biāo)識(shí)體)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)及熒光結(jié)合物(結(jié)合了熒光物質(zhì)的標(biāo)識(shí)體)的復(fù)合體的液相反應(yīng)工序。(2)通過(guò)形成的復(fù)合體與復(fù)合體結(jié)合的陰離子的移動(dòng)力，進(jìn)行等速電泳、濃縮的工序。(3)感知電位差，從等速電泳切換到區(qū)帶電泳的工序。(4)利用區(qū)帶電泳的復(fù)合體分離工序。(5)利用激光引起熒光測(cè)定的分析工序。該方法快速高效，極大地提高了檢測(cè)的敏感性和特異性。并能實(shí)現(xiàn)AFP+AFP-L3+維生素K缺乏或拮抗劑-Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)(PIVKA-Ⅱ)聯(lián)合檢測(cè)，提升了早期HCC的診斷效能，彌補(bǔ)單項(xiàng)檢測(cè)的不足[10]。同時(shí)，由于操作簡(jiǎn)便，快速且重復(fù)性好，該方法被越來(lái)越多的臨床實(shí)驗(yàn)室所接受。

3 AFP異質(zhì)體的臨床應(yīng)用

3.1肝臟疾病鑒別診斷 過(guò)去認(rèn)為AFP偏高一般意味著肝癌的發(fā)生，但許多良性肝臟疾病，如肝損傷、充血性肝大，也會(huì)使AFP升高，單憑AFP結(jié)果難以區(qū)分良、惡性病變。AFP-L3升高與肝癌細(xì)胞生成較多的AFP-L3分子有關(guān)，且AFP-L3占血清AFP的百分比(AFP-L3%)升高不依賴于總的AFP水平，體現(xiàn)了良惡性細(xì)胞的異質(zhì)性，能夠排除良性肝病引起的AFP升高[11-13]，具有更高的特異度。慢性乙型肝炎(CHB)患者血清中AFP-L3水平顯著高于健康人群[14]，且隨著Child-Pugh分級(jí)增加，血清AFP-L3水平呈上升趨勢(shì)[15]，進(jìn)一步說(shuō)明AFP-L3可檢測(cè)肝細(xì)胞損傷程度，作為評(píng)估肝功能的重要指標(biāo)。AFP-L3不受影像學(xué)陰影束縛[16]，其陽(yáng)性率與癌腫塊大小無(wú)關(guān)，而AFP水平與之呈正相關(guān)，小肝癌(癌最大徑<2 cm)患者中三分之一不會(huì)有AFP升高，但約35%患者血清中可檢測(cè)到AFP-L3[17]。AFP-L3陽(yáng)性的肝癌有快速生長(zhǎng)和早期轉(zhuǎn)移的潛在可能。

3.2PLC的療效評(píng)估及預(yù)后判斷 PLC患者血清中AFP-L3普遍高表達(dá)，并且與TNM分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]。目前治療肝癌的最有效方法依然是手術(shù)切除，早期切除對(duì)患者預(yù)后療效有一定幫助。切除后AFP水平隨之下降，下降速度與體內(nèi)AFP殘余量及半衰期有關(guān)。手術(shù)成功則一般AFP在兩個(gè)月內(nèi)轉(zhuǎn)陰，AFP異質(zhì)體將消失。若檢測(cè)結(jié)果顯示AFP下降明顯但未轉(zhuǎn)為陰性，AFP異質(zhì)體變化不明顯，則提示手術(shù)不徹底，癌組織還存在邊緣殘留或轉(zhuǎn)移等。若AFP異質(zhì)體下降至25%以下，與AFP水平保持相對(duì)恒定，則可能是肝炎或肝硬化所致[18]。

4 AFP異質(zhì)體的其他應(yīng)用

4.1在胚胎性腫瘤鑒別診斷中的價(jià)值 AFP主要由胎兒的肝細(xì)胞及卵黃囊合成[19]，妊娠期婦女體內(nèi)AFP水平會(huì)出現(xiàn)規(guī)律性波動(dòng)，胚胎性腫瘤會(huì)造成AFP異常升高，與肝癌較難區(qū)分。此時(shí)AFP異質(zhì)體的檢測(cè)在鑒別診斷中可起到一定作用。相關(guān)資料表示，肝癌患者血清中以LCA結(jié)合型為主，即AFP-L3占主要部分，而胚胎性腫瘤患者血清以LCA非結(jié)合型為主[20]。

4.2在篩查胎兒唐氏綜合征(DS)中的價(jià)值 DS是新生兒出生缺陷常見(jiàn)的一類遺傳性疾病。目前多采用孕中期母血清中AFP、游離β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)及游離雌三醇等標(biāo)志物進(jìn)行產(chǎn)前篩查，但檢測(cè)靈敏度均較低，只有60%～70%。有研究表明[21]，AFP-L2或AFP-L3在篩查DS方面優(yōu)于AFP。以AFP-L2、AFP-L3替代AFP并與游離β-hCG建立不同模型分析后結(jié)果顯示，以AFP-L2+AFP-L3+游離β-hCG篩查DS胎兒的AUC最高[0.929(95%CI:0.861～0.975)]。臨界值為1/1 636時(shí)，靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為0.907、0.857、0.764。

5 AFP異質(zhì)體與AFP聯(lián)合檢測(cè)在PLC中的應(yīng)用

AFP是PLC的血清標(biāo)志物，但有部分患者表現(xiàn)為持續(xù)性的AFP陰性[22],且AFP受妊娠等多種因素影響，部分良性肝病患者也可存在外周血AFP升高，因此AFP用于診斷存在漏診、誤診的可能。AFP-L3在肝癌細(xì)胞中特異性表達(dá),亓艷[23]等研究表明，AFP-L3單獨(dú)診斷HCC的靈敏度為56.52%，特異度為90.67%，準(zhǔn)確度為79.65%，特異度有所提高，但靈敏度和準(zhǔn)確度仍未令人滿意。目前臨床普遍采用AFP聯(lián)合AFP-L3對(duì)PLC進(jìn)行診斷，可在保證特異度的基礎(chǔ)上大大提高靈敏度和準(zhǔn)確度。AFP檢測(cè)陰性的患者可能AFP-L3檢測(cè)為陽(yáng)性，由于兩種檢測(cè)指標(biāo)存在不完全交叉，所以聯(lián)合診斷能夠彌補(bǔ)單指標(biāo)檢測(cè)的不足，提高臨床應(yīng)用價(jià)值。

6 結(jié)論與展望

AFP-L3對(duì)于早期診斷PLC具有十分重要的臨床意義，其靈敏度、特異度顯著高于AFP[24-26]。為提高PLC檢出的正確率和患者生存率，越來(lái)越多的AFP-L3聯(lián)合檢測(cè)方案被提出，但對(duì)于如何采用更好的檢測(cè)組合，以及簡(jiǎn)單、快速的實(shí)驗(yàn)方法，還有待于進(jìn)一步研究。