弱精子癥的線粒體分子機制研究進展

楊旭輝，陳柳青，吳遠菲

（廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科，廣東廣州 510160）

男性不育約占不孕不育人群的50%左右，其中弱精子癥在男性不育中約占19%。弱精子癥是指前向運動精子比例低于實驗室參考值（a+b<50%或a<25%），其他參數正常的病癥。精子活力是評估男性生育的一個重要指標。人精子活力主要來自能量物質氧化，其中線粒體作為精子中最重要的產能細胞器，主要通過能量物質的氧化磷酸化產生ATP為精子生命活動提供能量。完整的人線粒體DNA（mtDNA）是16 569 bp的雙鏈閉合環狀分子，編碼13條與細胞氧化磷酸化相關的多肽鏈，22種tRNA和2種rRNA。這13種蛋白質都是呼吸鏈酶復合物的亞單位，參與細胞的氧化磷酸化和ATP的產生。因此mtDNA對維持精子的正常活力具有至關重要的作用。線粒體基因組只有外顯子，而且缺乏抗氧化系統的保護，呼吸鏈在電子傳遞過程中容易溢出活性氧，最終損害毫無保護機制的線粒體DNA，任何位點的突變或缺失或替代等改變都會影響線粒體氧化磷酸化過程，進而可能影響精子活力，為了更深入了解精子活力下降的發病機制，許多研究開始關注線粒體DNA的改變，本文對此進行綜述。

1 精子線粒體DNA序列缺失

線粒體DNA4977-bp缺失：精子線粒體DNA是獨立于染色體的16 569 bp閉環雙鏈DNA，線粒體不僅是細胞內氧化磷酸化、形成三磷酸腺苷(ATP)的主要場所，為細胞生命活動提供能量;還是細胞內產生活性氧(ROS)的重要部位。mtDNA分子近乎裸鏈，既沒有組蛋白等保護又缺乏抗氧化機制，容易受到氧自由基攻擊而產生斷裂、缺失、突變等改變，進而影響了精子功能。1995年，Kao等[1]通過PCR檢測不育男性精子篩查4977 bp缺失，在弱精癥、少精癥和其他不育男性中發生率確實高于正常人群。1998年Kao等[2]進一步利用密度梯度離心分離獲得兩種活力截然不同的精子，從活力差的精子群中還檢測出mtDNA7345 bp和7599 bp的多發缺失，缺失率遠遠高于活力好的精子群。2017年Bahrehmand等[3]進一步利用GAP-PCR大規模篩查mtDNA缺失(256例弱精子癥患者和200例正常人精子)，觀察到弱精子癥4977 bp缺失率高達85.93%，而對照組僅14%，提示4977 bp缺失與弱精子癥相關性很強。Ambulkar等[4]在70例弱精子癥患者中檢出6名（6/70；8.57%）7436 bp的缺失，對照組未發現該缺失。40%的percoll組不運動精子數量多于80%的percoll組。40%percoll組分的非運動精子mtDNA 7436缺失率（7.2%）高于80%percoll組分的運動精子（2.7%）。提示精子中線粒體DNA的7436 bp缺失可能是導致精子功能障礙和不活動的重要原因之一。mtDNA 4977 bp缺失和其他類型mtDNA缺失將減少mtDNA編碼的蛋白質的合成，這些蛋白質對線粒體的呼吸功能是必要的，所以引起精子活力和生育力降低。Thangaraj等[5]發現，mtDNA編碼COXⅡ(細胞色素C氧化酶Ⅱ)的基因在弱精子癥患者中存在8195和8196缺失，并在8216位點產生一個終止密碼子（AGA），導致截短的蛋白高表達，能量供給不足，提示COXⅡ基因的缺失與精子活力低下相關。Mughal等[6]檢測36例弱精癥、20例少精癥、88例少弱畸形精子癥和44例正常樣本脫氧核糖核酸細胞色素C氧化酶Ⅲ亞單位15bp缺失率，觀察到弱精子癥患者中12例缺失(33.33%)，24例雜合(66.66%)，對照組野生型4例（9.09%），缺失13例（29.55%）和27例雜合（61.36%），在少弱畸精癥中，野生型2例（2.27%），41例缺失（46.59%）和45例雜合（51.14%）,認為COXⅢ(細胞色素c氧化酶Ⅲ)15 bp缺失與男性不育有顯著相關性。MTCYB是呼吸鏈復合體Ⅲ的亞基，主要催化電子轉運至細胞色素C，將質子從線粒體內膜轉運至膜外，對線粒體氧化磷酸化起至關重要的作用，而MTATP6參與精子氧化磷酸化過程ATP生成。馮春瓊等[7]在80例成年男性弱精子癥mtDNA中檢測出16例MTCYB片段缺失（20%），4例MTATP6基因片段缺失（5%）。同時MTATP6基因出現G8887A的點突變，突變率為20%，20例活力正常者的樣本中未檢測到明顯的點突變和缺失。以往的研究還發現MTATP6中T8821C、A8784G、C8829T突變，導致精子發育不良，直接影響精子活力。

2 線粒體DNA突變

線粒體DNA由于缺乏組氨酸和損傷修復系統的保護，又是活性氧產生的最重要細胞器，更易受到氧化損傷和其他有害因子攻擊導致突變，其DNA發生突變的頻率遠高于核DNA。

線粒體ND3、ND4L基因表達的多肽鏈是組成線粒體呼吸鏈和NADH脫氫酶的2個亞單位，這2個基因發生核苷酸變異的頻率比較高。李傳連等[8]在50例弱精子癥組和42例對照組中共檢測出線粒體DNAND3,ND4L基因核苷酸22個變異位點,其中G10320A、A10398G、T10609C為錯義突變。A10398G和C10400T核苷酸變異率在弱精子癥組顯著低于對照組,G10310A核苷酸變異率在弱精子癥組顯著高于對照組，推測線粒體DNA10398G-10400T多態性可能促進精子活力,線粒體DNAG10310A突變損害精子活力。Spiropoulos等[9]通過不同活力精子mtD‐NAA3243G突變分析，發現A3243G的高突變率與精子活力低下有關。Selvi等[10]也發現，弱精子癥患者mtDNAND4基因存在由異亮氨酸取代蘇氨酸的錯義突變（C11994 T）。Holyoake等[11]則證實正常人線粒體ATPase6基因9055位點和ND4基因11719位點單核苷酸置換率分別為1.3%和0，而弱精子癥患者的發生率為10.7%和12%，兩者間有顯著性差異。上述結果提示，mtDNA突變可能是精子活力降低的主要原因之一。NI等[12]觀察到97名弱精子癥患者和80名正常男性mtDNA中mt-nd4基因分別有64個和54個核苷酸替換，突變率無差異（66.0%對67.5%，P>0.05）。但有一個突變（G.11084A>G，P.T109A），導致高度保守區的氨基酸被取代，并預測其可能有害。對于mt-tl1，在弱精子癥患者中檢出一個新的突變（g.3263c>t），在正常對照組中沒有。結果表明，mt-nd4和mt-tl1基因可能與中國男性不育有關。Baklouti-Gargouri等[13]篩選了突尼斯人群中患有弱精子癥的不育男性(n=34)的體細胞線粒體COX I(細胞色素氧化酶I)基因，并與正常可育男性(n=100)進行了比較。在5例弱精子癥患者(14%)中發現了一種新的同源錯義線粒體突變(m.6375A>G)，但在正常生育男性中未發現。這種突變將158位的異亮氨酸替換為高度保守氨基酸中的纈氨酸，可導致蛋白質三維結構數(從50降低到26)的降低。Baklouti-Gar‐gouri等[14]檢測31例弱精癥患者和100例正常人精子線粒體COXI發現6例弱精癥患者存在m.6307A>G突變，在正常人群中未檢測到。m.6307a>g突變將高度保守區135位天冬酰胺替換為絲氨酸，這種突變可能會削弱精子活力。Baklouti-Gargouri等[15]在31例弱精癥患者線粒體COXⅢ基因檢測到一個新的突變點m.9588G>A，所有弱精癥患者都攜帶這個突變，m.9588g>a突變將高度保守區128位的谷氨酸替代為賴氨酸。這個突變可能影響線粒體中從還原細胞色素C到分子氧的電子轉移，進而影響精子活力。Baklouti-Gargouri等[16]從34例弱精癥患者中發現3例存在COXⅢ基因上一個新的錯義線粒體突變點m.9387 G>A，正常人群不存在，這一突變將高度保守區61位的纈氨酸替換為蛋氨酸，可能參與精子活力的發生過程。Shamsi等[17]回顧性分析49例弱精子癥患者的mtDNA突變和缺失，顯示缺失和突變位點通常發生在atpase 6、atpase 8和coii基因。在23例弱精子癥患者中22個發生核苷酸替換，9個發生在atpase 6基因，6個在atpase 8基因，7個在coii基因。在22個核苷酸突變中，5個是錯義突變，17個是沉默突變。該研究對另外23名少弱精子癥患者mtDNA分析當中檢測到基于OXPHOS通路的mt突變，其中20名患者存在核苷酸8860處a>g的轉換，12名患者存在核苷酸8701處a>g的轉換。提示線粒體基因組突變與精子運動能力受損等精液參數差有關。樓哲豐等[18]在弱精子癥患者中篩查tRNAHis、tRNASer（AGY）、tRNALeu（CUN）基因突變，132例弱精子癥患者中19例標本檢出9個突變位點,其中tRNAHis基因突變位點2個,tRNASer（AGY）基因3個,tRNALeu（CUN）基因4個。tRNAS‐er（AGY）基因突變在弱精子癥組的發生頻率（7.58%）高于 正 常 對 照 組（1.02%）,其 中tRNASer（AGY）基 因m.12234A>G突變6例,正常對照組中未檢出，tRNAS‐er（AGY）基因m.12234A>G突變可能是弱精子癥發生的相關因素。Siwar等[19]在正常不育男性中發現缺失的COXⅡ基因（m.8021g/a）。這種突變將146位的異亮氨酸替換為蛋白質跨膜功能域中保守氨基酸中的纈氨酸。在tRNA（His）基因中檢測到第2個突變（m.12187C>A），在正常人中不存在。它在整個進化過程中是保守的，并影響線粒體tRNA（His）54密碼子處T-環區域。

3 蛋白質和核酸分子表達量異常

完整的人線粒體DNA（mtDNA）是雙鏈閉合環狀分子，編碼13條與細胞氧化磷酸化相關的多肽鏈，22種tRNA和2種rRNA。這13種蛋白質都是呼吸鏈酶復合物的亞單位，參與細胞的氧化磷酸化和ATP的產生，在維持精子活力方面發揮重要作用。有研究[20]證實弱精子癥患者線粒體COXI和Ⅱ表達明顯降低,凋亡率顯著增加,線粒體膜電位顯著降低,這是精子活力下降的重要原因。另外有研究[21]檢測4種線粒體相關mirna（miR-4485-3p/4484/4461和4463）在弱精子癥樣本中的表達，發現與對照組相比，弱精子癥組（AZS）miR-4485-3p顯著下調，生物信息學分析確定了miR-4485-3p（DNAH1、KIT和PARK7）與男性不育相關的3個靶基因。miR-4485-3p的下調與特發性AZS有關。Wang等[22]分別檢測正常精子和弱精子癥供體精子解偶聯蛋白2（UCP2）蛋白、線粒體活性氧（mROS）水平和精子線粒體膜電位（MMP）活性，證實UCP2弱精子癥組表達明顯下降。進一步用Genipin抑制UCP2表達，不僅導致精子活動性受損，而且導致mROS水平升高，提示UCP2-mROS的運動調節系統存在于人類精子的運動中。UCP2通過促進mROS的消除來調控精子運動。

有絲分裂融合蛋白2（MFN2）是一種線粒體膜蛋白，Fang等[23]發現弱精子癥組MFN2表達明顯低于正常組，此外，抗凍組（冷凍存活率>40%）中MFN2的表達水平顯著高于冷凍不耐受組，證實MFN2的表達水平與人類精子的運動和低溫保護電位有關。MFN2可能是弱精子癥機制研究的新靶點。Prohibitin（PHB）也是一種主要的線粒體膜蛋白，Chai等[24]發現弱精子癥（A)和少弱精子癥（OA）患者的精子mROS和脂質過氧化水平顯著高于正常人，而MMP和PHB的表達顯著低于正常人。mROS與脂質過氧化呈正相關，與PHB表達、高MMP、精子活力呈負相關。提示mROS水平升高并與PHB表達降低相關，它可能通過增加低MMP和脂質過氧化來調節精子的運動。PARK7（DJ1）是一種多功能氧化應激反應蛋白，可保護細胞免受活性氧（ROS）和線粒體損傷。Sun等[25]在研究中發現PARK7的下調導致弱精子癥患者精子中脂質過氧化物和ROS水平升高，線粒體膜電位降低，線粒體復合物I酶活性降低。提示PARK7缺乏可能增加精子的氧化應激損傷。為以PARK7為靶點的治療弱精子癥開辟了新的途徑。線粒體烏頭酸酶（ACO2）是一種重要的三羧酸循環調節酶，與正常可育男性相比，弱精子癥精子樣本中的ACO2蛋白水平顯著降低[26]。弱精子癥不育男性琥珀酸脫氫酶表達[27]與正常對照染色強度集中在精子中段相比，弱精子癥患者SDH在精子頭部和中段區域呈彌散分布。SDH的分散表達表明，代謝或遺傳因素導致線粒體損傷，影響能量產生，導致精子運動紊亂，具有病理意義。Zhou等[28]發現與健康對照組相比，重度弱精子癥患者的sp-miR-151a-5p顯著升高。miR-151a-5p-mimics的轉染降低了線粒體呼吸活性和三磷酸腺苷（ATP）水平。當miR-151a-5p過度表達時，細胞色素b（Cytb）mRNA和蛋白水平也降低。提示miR-151a-5p通過靶向弱精子癥中的CYTB減少細胞ATP的產生。

4 mtDNA容量

mtDNA容量是mtDNA拷貝數，是反映線粒體DNA數量的指標。哺乳動物體細胞mtDNA拷貝數為大約103～104，而成熟精子mtDNA拷貝數僅50～75個，提示精子發生過程中存在mtDNA拷貝數成倍下降的趨勢。各國的研究者發現精子mtDNA拷貝數和精子活力及男性不育呈現出顯著的負相關性。mtDNA拷貝數在不同活力精子間具有差異，活力越好，mtDNA拷貝數反而越低，活力越差，其拷貝數反而增高。精子mtDNA拷貝數可以作為精子活力是否正常的一個重要參數，高建芳等[29]對161例成年男性精子質量及mtDNA拷貝數的檢測及相關性分析，結果發現mtDNA拷貝數與精液質量顯著負相關，質量越差的精子拷貝數越高。May-Panloup等[30]分析密度梯度離心后不同離心層精子的mtDNA拷貝數，用實時定量PCR法測定mtDNA/β-珠蛋白基因的比值發現，從100%密度層采集的精子平均mtDNA/β-珠蛋白比率為1.4（正常精子），6.1（出現至少1個異常標準的精子樣本），9.1（出現其中2個或多個異常標準的精子樣本）。從40%密度梯度層收集的精子平均mtDNA/β-珠蛋白比率為17.1，40%梯度液層含大量不活動精子，提示從異常精子樣本中采集的精子中，mtDNA拷貝數有明顯增加。Chen等[31]研究證實，與正常人相比，弱精子癥和少弱精子癥患者有顯著更低的精漿游離mtDNA拷貝數，精漿游離mtDNA拷貝數與精子濃度、運動、形態和運動特征呈正相關，與活性氧水平呈負相關。提示精漿游離mtDNA拷貝數與精液參數有關，可作為另一個精液質量的新診斷指標。

5 mtDNA單體

Ruiz-Pesini等[32]研究證實，弱精子癥患者精子mtDNA單體分布中T單體明顯增多，認為mtDNA單體分布異常與精子活動力低下有相關性。

綜上所述，精子mtDNA缺失、突變、各種線粒體相關蛋白質核酸分子含量變化，mtDNA容量改變、單體型等問題均可能引起包括精子活力降低的各種功能異常，我們借助各種諸如realtime-PCR、多重PCR等技術從分子生物學角度探索和闡明弱精癥基于線粒體DNA的發病機制，已經取得了一定的進展，為從分子水平研究弱精子癥的發病機制奠定了實驗基礎，為發現具有臨床診斷和治療意義的靶基因對弱精癥進行靶向治療提供了實驗依據。