Wnt/β-catenin信號通路調控成骨細胞、破骨細胞在骨質疏松中的作用探討

張帆 梁清洋 韓超 劉佳* 唐毓金*

1.右江民族醫學院附屬醫院骨外科，廣西 百色 533000 2.右江民族醫學院臨床醫學院，廣西 百色 533000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種與衰老相關的骨骼疾病，包括骨質和骨骼結構的惡化，從而增加骨折的風險。OP是我國最常見的慢性疾病之一，在老年人的骨疾病中居于首位。社會老齡化的日益加重，使我國OP患者數量突破了1億，預計30年后，患者數量極有可能增長一倍。流行病學調研[1]顯示，年齡超過50歲的人群OP患病率為19.2 %，其中男性為6.0 %，女性為32.1 %，城市地區為16.2 %，農村地區為20.7 %，年齡超過60歲的人群患病率更是超過30 %?？梢缘贸觯S著未來我國老年人口數的不斷增加，骨質疏松癥將持續成為一場公共衛生和醫療保健領域的嚴峻挑戰。

成骨細胞(osteoblasts，OB)起源于骨髓間充質干細胞(BMSC)，是存在于骨組織中，起到接受刺激和發揮效應作用的細胞，它最終可以分化為成熟的骨細胞。各種因素的刺激都可以造成細胞分化的增殖或凋亡，產生許多骨骼相關的疾病[2]。破骨細胞(osteoclasts，OC)，由Kolliker于1873年首次發現，來源于單核-巨噬細胞系，主要負責調控機體的骨吸收。破骨細胞還通過分泌可溶性因子(包括S1P、CTHRC1和C3)影響成骨細胞的形成和分化。成骨細胞/破骨細胞軸功能異常在OP的發展中起關鍵作用，只有成骨和破骨達到一種穩態，才能使機體骨量維持正常，否則，就容易發生OP、骨硬化癥等骨病。

1 Wnt信號通路的組成及細胞內調控機制

自1982年努斯(R Nusse)和瓦爾莫斯(HE Varmus)首次發表涉及Wnt家族的第一篇文章以來，對Wnt信號的探索逐漸深入，涉及細胞的分化、維持、免疫、應激、癌變和凋亡，機體的生長、發育、疾病、衰老與死亡等多個方面。Wnt是一大類糖蛋白的統稱，它們多位于細胞外，以結構中存在大量的半胱氨酸為特征。

Wnt信號轉導包括經典的β-catenin途徑、平面細胞極性途徑和Wnt/Ca2+途徑等。本文重點關注依賴β-catenin的經典通路。研究[3]發現組成經典Wnt信號通路的傳導分子包括Wnt分泌蛋白、跨膜受體卷曲蛋白、松散蛋白、β-連環蛋白、糖原合成激酶3β、軸蛋白、T細胞因子/淋巴增強因子、酪蛋白激酶1、低密度脂蛋白受體依賴性蛋白5/6等。β-連環蛋白是重要的功能蛋白之一，早期發現其具有粘附分子的作用，維持細胞膜的穩定，還涉及重要的細胞活動-信號轉導，它是介導成骨細胞生長和分化的關鍵因子。其中β-catenin的細胞核內含量的變化是信號轉導的關鍵步驟。

Wnt配體是一類分泌型糖蛋白[4]，含有19個胞外配體的大家族，可以同時激活Wnt經典和非經典途徑，從而誘導復雜信號網絡的形成。首先，Wnt蛋白先粘附到細胞表面，與Frz和LRP5 /6受體復合物相結合，再繼續活化細胞膜內的Dsh蛋白，Dsh蛋白活化后可抑制GSK3β，使β-catenin可以和鈣粘附蛋白E組成復合體，然后β-catenin不斷地積聚，向細胞核定向移動，主動的結合轉錄因子TCF/LEF，形成基因轉錄的復合體，最后在相關輔助因子的作用下啟動轉錄過程，調控靶基因的表達，產生生物學效應。這樣，信號就由Wnt蛋白這一個位點開始轉導到整個通路上，然后對整個機體產生網狀的效應。

2 對成骨細胞的調控作用

成骨細胞的功能主要是分泌膠原纖維和蛋白多糖，在骨形成階段發揮作用。在骨骼受到損傷時，機體首先反應是成骨細胞增殖、成熟，形成新生的骨組織，這個過程受到各種因素的調控，如果成骨受到影響就可能導致骨質疏松。

研究發現在體內Wnt3a可以激活β-catenin，在體外Wnt3a等蛋白可以抑制成骨細胞的凋亡。彭楊茜子等[5]發現Wnt3a可以促進小鼠成肌細胞(C2C12)的增殖、提高ALP的活性和加強骨保護素的表達，最終促進成骨。基因研究[6]發現KLF14在BMSC中高表達，抑制KLF14表達可促進BMSC的成骨分化，Wnt3a啟動子與KLF14相互作用，導致Wnt3a和Wnt信號通路中下游成骨相關靶基因的表達下降。也有研究[7]認為Wnt3a與骨形態發生蛋白9具有協同作用，共同加強堿性磷酸酶在間充質干細胞中的表達。Wnt3a也可以調控雌激素受體的表達，雌激素正向調節BMSC向成骨方向分化。

Bennett等[8]培育人骨鈣素啟動子過表達的轉基因小鼠，發現股骨骨密度、骨體積分數和骨小梁數較野生型小鼠顯著增高，而成骨細胞凋亡或破骨細胞數量和活性無明顯變化，得出Wnt10b主要通過刺激成骨細胞的生成來增加骨量。Wnt16被認為是皮質骨的重要調節蛋白，可以增加體內皮質骨骨小梁的質量和強度。魏雙雙等[9]研究發現將Wistar雌性大鼠切除雙側卵巢后，雌激素分泌減少，導致骨質疏松，補充外源性雌激素4個月后，檢測Wntl6mRNA表達升高，說明雌激素也可能通過Wnt16進一步調節成骨。Wnt5a是Wnt家族的非典型成員，既往研究僅涉及非經典Wnt途徑。實驗中，構建Wnt5a-/-基因小鼠，發育成熟后小鼠表現出低骨密度，骨礦化減少[10]。Wnt5a還可以抑制β-catenin信號，降低特異性周期蛋白-D1的水平進而抑制Wnt3a。新的一項研究[11]表明它也可以影響ROCK的活性來促進ALP活性升高，提高RUNX2和骨鈣素基因的表達，下調成脂標志物等，可能影響經典Wnt通路。同時，Wnt信號在成骨超過正常時，自身的促進成骨作用減弱以維持機體的骨平衡[12]。

3 對破骨細胞的調控作用

破骨細胞是一種非傳統意義的多核巨噬細胞，通過單核前體細胞融合形成，與骨吸收、骨重建密切相關。破骨細胞分化成熟的過程受到多種細胞因子的調控，Wnt信號轉導通路激活后，可以調控破骨細胞的表達。細胞研究[13]表明β-catenin和TCF蛋白一樣，都可以調節存在于成骨細胞中具有抑制破骨細胞分化作用的骨保護素的表達。構建轉基因小鼠模型，將β-catenin基因敲除后，發現破骨細胞表達增加，小鼠表現重度骨質疏松，提示Wnt信號可能是負向調控破骨細胞的分化來維持骨穩態。

Wnt3a間接調控破骨細胞。研究[14]證實Wnt3a可以通過成骨細胞調控RANKL的表達，來抑制破骨細胞生成。RANKL/OPG/RANK信號途徑是破骨細胞形成和活化的主要調控系統。RANKL是破骨細胞分化和骨吸收的關鍵介質[15]。成骨細胞譜系細胞(包括成骨細胞和骨細胞)表達RANKL，RANKL受多種不同因素的調節，包括激素，細胞因子和機械力等。RANK的化學本質是一種跨膜蛋白，在單核/巨噬細胞內發現。OPG是一種腫瘤壞死因子受體(TNFR)，一種糖蛋白，存在形式有分子質量為60 ku的單體和分子質量為120 ku的同源二聚體。OPG的作用是直接抑制RANK/RANKL復合體的活性，也可通過與RANK競爭性結合RANKL，間接抑制骨吸收。Kondo等[16]發現，糖皮質激素通過下調OPG的表達，抑制Wnt信號通路從而造成骨量下降。人工敲除小鼠OPG基因，小鼠會發生骨質疏松癥，如果該基因過度表達，將可能導致石骨癥。目前人工重組OPG、RANKL單克隆抗體已應用于臨床[17]。

Wnt5a可以激活經典Wnt信號通路，也可以直接作用于破骨細胞[18]，成骨細胞及滑膜細胞分泌的Wnt5a與破骨細胞前體細胞中Ror2結合，共同激活JNK，進而c-Jun被招募到RANK啟動子Sp1，促進RANK的表達，從而增強破骨細胞生成。Wnt16通過非經典途徑抑制T細胞核因子(nuclear factor of activated Tcells 1，NFAT1)激活，實驗中如果將已被特異性敲除Wnt16(Wnt16-/-)的成骨細胞在1α,25-二羥維生素D3誘導條件下與破骨細胞共同培養，可以發現破骨細胞的分化增強，這進一步證實Wnt16負向調控破骨細胞的形成[19]。另外，Wnt16也可以激活MC3T3-E1細胞(小鼠前成骨細胞)中的Wnt/β-catenin信號，誘導OPG的表達，進而抑制RANK-RANKL相互作用間接抑制破骨細胞分化。由此，推斷Wnt蛋白在破骨細胞不同階段可能都具有調控功能。

4 Wnt信號異常對OP發生發展的作用

人體骨骼系統持續不斷的進行著骨吸收與骨重建，這個動態循環中，破骨細胞分化成熟后進行骨吸收，成骨細胞負責形成新生的骨質。成骨細胞和破骨細胞通過直接的細胞間接觸或分泌蛋白相互溝通，以調節細胞行為、存活和分化。成骨細胞發生退變或破骨細胞過度活躍都會導致骨的微細結構和生物力學的改變，從而導致OP[20]。Wnt/β-catenin信號的兩個抑制劑Dickkopf-1(DKK-1)和SOST在骨穩態中起著關鍵作用，其不僅是藥物調節的潛在靶標，還是可溶性的生物標志物。

DKK的研究主要涉及骨代謝和腫瘤等領域。研究最成熟是DKK-1[21]，它是含有2個富含半胱氨酸結構域的一種分泌性糖蛋白，通過與Wnt競爭性結合LRP5/6受體，來阻斷Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制骨形成。一項國外大數據臨床研究發現OP患者血清DKK-l顯著高于正常組。Li等[22]發現用表達BMP9的腺病毒轉染大鼠卵泡干細胞后，給予高濃度的DKK-1可以減少BMP9轉導的大鼠卵泡干細胞的成骨分化，而低濃度的DKK-1則促進了BMP9誘導的骨形成，這是通過經典和非經典Wnt信號通路共同作用的?；蜓芯縖23]表明，小鼠DKK-1基因的表達水平與其本身的的骨量呈負相關，DKK-1水平越高，越使骨組織的微細結構被破壞，骨強度減低，骨量減少，提示我們DKK-1檢測可以用于評估骨質疏松的嚴重程度。新的研究[24]揭示骨質疏松也與鐵的過載有關，通過小鼠動物模型研究發現，在正常情況下經典Wnt信號通路中的β-catenin與下游TCF/LEF家族中TCF4/TCF7L2分子結合促進骨形成。在鐵蓄積情況下β-catenin與下游TCF4/TCF7L2分子結合減少，與FOXO3a結合增多，因此會抑制經典Wnt信號通路，抑制骨形成進而導致骨質疏松。所以，在臨床上可以使用鐵螯合劑，例如去鐵胺、乳鐵蛋白等改善骨質疏松。

硬化蛋白(Sclerostin)是骨骼中的天然激素，一種由骨細胞合成的抗合成蛋白。在骨骼中起分解代謝作用，并通過增加破骨細胞的骨吸收參與骨代謝的調節。硬化蛋白水平隨年齡增長而增加，其可用性增加的結果可能是Wnt信號級聯的破壞。研究[25]發現，SOST基因小鼠的皮質骨中硬化蛋白的表達比小梁骨中的表達更明顯。用抗RANKL抗體治療C57BL/6小鼠后，小梁骨中硬化蛋白陽性細胞數量增加，而小梁骨中β-catenin陽性細胞數量和骨形成減少，說明骨小梁中硬化蛋白的表達受抑制可以促進骨轉換。Miyatake等[26]發現，IL-1β在OA晚期誘導軟骨形成分化，并促進終末鈣化。硬化蛋白在晚期可以恢復IL-1β誘導的β-catenin信號的上調，在維持關節穩態中起關鍵作用。Ohsugi等[27]發現，激光的生物刺激作用抑制了原代成骨細胞中SOST的表達。激光通過抑制硬化蛋白表達而不引起炎癥，可能成為骨質疏松癥的一種新治療方法。羅莫珠單抗(Romosozumab)是一種人源化單克隆抗體，可特異性地結合骨硬化蛋白，拮抗其對骨代謝的負向調節作用，保證Wnt/β-catenin信號通路的正常傳導。

5 小結與展望

骨質疏松癥的藥物按原理不同可分為骨吸收抑制劑、骨形成促進劑等[28]。雙膦酸鹽類是傳統的一線用藥，較常見的是阿侖膦酸鈉，用藥后破骨細胞活性受到抑制，骨形成增加，機體骨量升高，但也有研究表明其有導致骨折不愈合的風險。甲狀旁腺素(PTH)[29]是目前較新的骨形成促進劑，PTH給藥后可提高血清鈣水平。實驗發現，PTH可通過β-catenin信號阻斷糖基化終末產物(AGEs)對大鼠BMSC的負性成骨作用，顯著增加骨量[30]。臨床研究發現，與安慰劑和替代性骨質疏松療法相比，使用Romosozumab后，骨礦物質增加，新發椎體骨折顯著減少[31]。Romosozumab使用后短期就有促進骨形成的作用，長期應用還可以減少骨吸收，可能為臨床上治療骨質疏松提供新的方向。另外，Denosumab一種新的RANKL中和抗體的出現，表明應用Wnt通路靶點的抑制劑和中和抗體在治療OP方面具有嶄新的前景[32]。動物研究[33]中，構建骨質疏松性骨折大鼠模型后，發現BMSC組大鼠骨密度恢復快、力學負荷明顯改善和骨折線愈合良好，表明骨髓間充質干細胞的移植也可能治療骨質疏松。Li等[34]對比糖尿病骨質疏松癥和對照組C57BL/6小鼠高級糖基化終產物的變化，發現AGEs可以通過激活DNA甲基化并抑制β-catenin途徑來抑制脂肪干細胞的成骨分化能力，證實DNA甲基化可以增強骨修復和促進骨再生。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號通路可以調節與骨相關的生物信息信號傳遞，還有更多的預防和治療骨質疏松的潛在藥物靶標尚未被發現。