誘導多能干細胞在治療阿爾茨海默病中的應用進展

李夢潔，章麗娜，商迎輝，黃漢昌，勞鳳學

生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室/北京聯合大學功能因子與腦科學研究院/生物化學工程學院，北京 100191

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種慢性中樞神經系統退行性疾病[1]，其病理變化包括β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積、tau蛋白過度磷酸化、神經元和突觸丟失等。AD的發病與多種因素有關，包括遺傳因素、神經遞質、免疫因素和環境因素等。近年來，臨床上對AD發病機制的認識主要包括Aβ理論、tau蛋白理論、氧化應激學說、炎癥機制、自噬理論等，但其具體發病機制仍未明確[2]。針對AD治療的新藥研發旨在減輕癥狀、減緩疾病進程，臨床試驗中的藥物仍無法完全治愈本病[3]，包括已在國內完成三期臨床試驗的GV971[4]與美國食品和藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準的多奈哌齊等。因此對AD的治療策略也從疾病發展的后期治療轉向早期預防[5]。目前研究表明，誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)作為一種多能神經細胞，能夠分化為所有細胞類型，推動了干細胞治療(如細胞替代療法)的發展，這使治愈AD成為可能[6]。 自iPSCs技術出現以來，源自人類誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)的神經元已應用于各種形式的神經退行性疾病，包括AD、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、亨廷頓病(Huntington's disease，HD)和肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等。iPSCs為建立遺傳學和生理學模型提供了一種新穎的方法，可用于深入研究AD的發病機制及其治療策略[7]。

1 iPSCs技術

2006年，Takahashi等[8]從候選的24種因子中篩選出4種轉錄因子(Oct4、Sox2、Myc和Klf)，通過反轉錄病毒載體使其在小鼠成纖維細胞中過表達，獲得類似于胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)的多能性干細胞，稱其為“iPSCs”。iPSCs來源于體外成熟的體細胞，如皮膚成纖維細胞或血細胞[9]等，經小分子或病毒載體傳遞的轉錄因子進一步行遺傳修飾，使其在表型和分化能力上具有多樣性和胚胎干細胞樣狀態，具有無限自我更新和分化為所有細胞類型的能力[10-11]。iPSCs衍生的神經元具有結構和功能特征，能夠形成電生理活性突觸網絡[12]。在誘導過程中使用額外的轉錄因子，能夠直接有效地將人成纖維細胞分化為特定的神經元亞型，如多巴胺能神經元[13]。

近年來，誘導iPSCs的技術也有所改進，從采用反轉錄病毒或慢病毒作為載體轉變為采用非病毒構建體整合以誘導iPSCs[8,14]。研究表明，非病毒構建體的整合比病毒載體更穩定[15]。現已建立了多種可產生iPSCs的無病毒整合系統，如腺病毒、仙臺病毒、微環載體、外體載體和直接蛋白質遞送等[16-17]。 一些小分子細胞，如VC6T、FSK，也被證實可以取代Sox2和Oct4用來誘導細胞重編程[18]。

iPSCs技術為人類疾病提供了相應的治療方案，特別在神經發育障礙方面[19]。iPSCs能夠克服動物模型的局限性，建立體外二維(two-dimensional，2D)細胞培養體系和三維(three-dimensional，3D)細胞模型，以此分析神經病理學的表型特征。除此之外，iPSCs具有很強的自我更新和分化能力，能產生大量患者特異性iPSCs，很大程度上減少了使用ESCs帶來的倫理問題，也使藥物篩選和評估前藥、新療法的療效成為可能。目前iPSCs已廣泛應用于基礎研究、疾病建模、細胞療法和藥物篩選。

2 iPSCs與AD細胞模型

在iPSCs建立的疾病模型出現之前，研究人員通常采用小鼠動物模型來研究AD。盡管小鼠和人類有一部分的同源基因，但沒有任何一種小鼠模型能夠完全展示AD患者的病理表現[20]。利用患者本身的細胞或組織產生的iPSCs不僅可以避免上述問題，也避免了非患者特異性來源的倫理限制和免疫排斥問題[11]。除此之外，iPSCs建立的疾病模型已由2D培養逐漸發展為3D培養，后者可以在相對較小的容器中培養大量iPSCs，降低培養的成本[21]，還可構造出細胞生長所需的復雜環 境[22]。最新研究表明，利用微流體裝置建立3D模型可以模擬復雜的細胞相互作用、多細胞結構、細胞間功能單元及其相互作用的物理微環境[23]；在體外微流體系統中的研究顯示，成釉細胞瘤在體內被神經支配，能表達干細胞標志物、Notch信號通路分子和神經營養因子，因此3D人類神經細胞培養模型對精確的AD建模至關重要[24]。目前與AD發病機制相關的iPSCs模型主要有早老素1(presenilin-1，PSEN1)突變、早老素2(presenilin-2，PSEN2)突變、淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)突變等類型，從不同細胞誘導的iPSCs模型中可以診斷AD的生物標志物，從而揭示AD的發病 機制。

2.1iPSCs誘導的PSEN1、PSEN2突變模型 PSEN1的典型突變包括DE9、L166P、E280A、M146V、M233L，近年來新發現的突變包括A246E或 Y256N、H214R和G206V[25-26]。PSEN1的所有突變體均會增加Aβ42:Aβ40的比率[27]。

從攜帶PSEN1 DE9突變的AD患者中產生的iPSCs模型顯示，致病性的PSEN1 DE9突變導致AD患者星形膠質細胞表現出嚴重的疾病表型，包括iPSCs衍生的AD星形膠質細胞促進AD的斑塊形成、DE9突變干擾內質網中Ca2+的釋放[28]、影響線粒體代謝、DE9星形膠質細胞在炎癥刺激后分泌刺激因子(白細胞介素-2、白細胞介素-6、白細胞介素-10和粒細胞巨噬細胞)。早期研究表明，PSEN1的突變體可激活和抑制γ-分泌酶的活性，而DE9突變對γ-分泌酶整體無影響[29-30]，研究結果有差異的原因在于攜帶PSEN1 DE9突變的不同患者之間存在巨大的臨床異質性以及不同的研究使用了不同的方法來評估γ-分泌酶的活性[31]。

PSEN1 L166P突變是最具攻擊性的家族性阿爾茨海默病(familial Alzheimer's disease，fAD)突變之一，攜帶L166P突變的AD患者生成的iPSCs衍生的神經元中核內體大小顯著增加，而這一變化可通過β淀粉樣前體蛋白裂解酶(beta amyloid precursor protein lyase，BACE)治療[32]。鮮有研究的PSEN2 N141I突變模型也顯示了該結果[33]，且沒有觀察到tau蛋白在其中的作用機制[34]。研究PSEN的突變模型還有源于早發患者的PSEN1 E280A iPSCs[25]、攜帶PSEN1 A246E[35]的fAD患者衍生的iPSCs等。由此可見，iPSCs衍生的細胞可以提供一種新的工具用來識別AD的生物標志物。

2.2iPSCs誘導的APP突變模型 APP突變包括KM670/671 NL、A692G、APP swe、V717G、A673T、D678H、V717I、APP復制等[27,36]。研究顯示，A692G和APP swe突變對Aβ42:Aβ40的比率無影響，V717G突變會增加Aβ42:Aβ40的比率，而A673T作為一種罕見的APP突變可導致Aβ的生成減少，降低了人群患AD的風險[37]。D678H點突變對疾病的影響更為顯著，該突變位點位于β-分泌酶切割位點附近，一方面，這有可能引起APP構象變化，從而導致Aβ的累積；另一方面，該位點附近的D678N和H677R突變可加速Aβ纖維的形成[38]。研究人員對2例攜帶APP D678H突變的AD患者產生的iPSCs進行觀察發現，來源于AD-iPSCs的神經元表現出Aβ的異常累積和tau蛋白的異常磷酸化。該突變使半胱天冬酶1保持高活性，且使軸突生長受損。其中，軸突生長受損的主要原因是糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase，GSK3β)的激活會增加tau蛋白磷酸化和軸突回縮[39]。此外，V717I突變[40]和APP復制[41]也會導致Aβ的異常累積，V717I點突變會使tau蛋白總量和tau蛋白磷酸化水平升高；APP復制會導致tau蛋白異常磷酸化，激活GSK3β的活性[40]。

大多數的AD為散發性、晚發型，但有1%～2%的病例為家族性早發型，伴有PSEN1、PSEN2和APP基因的潛在突變。在攜帶APP突變的患者產生的iPSCs模型中，出現的病理特征均是AD的早期事件，而疾病后期出現的其他病理特征如Aβ聚集、神經纖維纏結、神經元凋亡等在模型里并未出現。因此利用該類模型模擬疾病早期的病理特征，能夠為疾病的早期診斷以及對應的靶點治療提供一個良好的平臺。

2.3iPSCs模型與AD生物標志物的篩選 數十年來臨床試驗的多次失敗表明，AD治療確實存在一定的難度[42]，在神經細胞出現不可逆死亡之前，對AD患者進行更早期的診斷和臨床干預已成為AD治療的關鍵。因此對AD的治療策略也轉向疾病發展早期的診斷與預防，旨在正電子發射斷層掃描(positron emission tomography，PET)發現腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中的淀粉樣蛋白負荷之前，盡早發現表現為先驅癥狀或無癥狀的AD患者。2017年，研究人員通過對AD-iPSCs衍生的神經元培養液進行分析來鑒定CSF候選生物標志物，最終在對5個候選多肽的分析中發現α1-酸性糖蛋白(alpha-1-acid glycoprotein，ORM1)顯著減少。因此如果在疾病早期觀察到CSF中ORM1的顯著變化，將有助于確定延緩發病的用藥時間[43]。最新研究表明，對致病基因表達譜和候選新藥進行電子分析，利用GSE117589微陣列數據集對AD患者和健康對照的iPSCs來源的神經祖細胞(neuronal progenitor，NP)和神經元之間的差異表達基因進行鑒定，采用判別分析模塊(discriminant analysis module，DAM)算法可以識別疾病的生物標志物[44]。在這項研究中，對散發性阿爾茨海默病(sporadic Alzheimer's disease，sAD)患者iPSCs來源的NP與非癡呆對照組的NP進行分離，列出了10個預測因子，其中包括MEIS2、HOXA2、COL23A1等基因。同時，iPSCs來源的神經元經DAM分析后確定了12個預測因子，其中包括COLI1A1、SYT17、TFPI2等。其驗證結果與 Patel等[45]的觀察結果一致。因此，使用基于iPSCs的模型可以識別早期易感個體，也為利用iPSCs來源的神經細胞模型來篩選早期診斷AD的生物標志物奠定了基礎。

3 iPSCs與AD細胞療法

在AD的治療中，基于iPSCs的細胞替代療法的主要目的之一是產生新的神經元來替代疾病進展過程中丟失或存在功能缺陷的細胞，或者產生膠質細胞來保護神經元以避免其退化[46]。神經干細胞(neural stem cells，NSC)移植不僅為AD的治療提供了直接的細胞替代策略，還能通過促進神經營養因子的釋放而發揮神經保護作用，通過各種機制改善AD動物模型的認知能力，以逆轉AD的病理狀 態[47]。除此之外，NSC移植也被用作遞送潛在治療劑的載體，包括奈普利賴氨酸、胰島素降解酶、纖溶酶和組織蛋白酶B，以降低AD小鼠模型中的Aβ水平[48]。研究表明，反轉錄病毒轉導能夠成功地產生人類神經前體細胞，并且這些細胞在移植到發育中的動物大腦后具有存活、遷移和分化成不同譜系細胞的潛力[46]。

3.1iPSCs技術與細胞移植 經小鼠iPSCs分化的NSC移植到小鼠胚胎腦后會遷移到不同的腦區域，并分化為神經膠質細胞和神經元，從而彌補退化的神經元。hiPSCs衍生的巨噬細胞樣細胞移植到5xFAD轉基因AD小鼠模型，經遺傳修飾后能表達一種降解Aβ的蛋白酶，從而降低Aβ的水平[49]。研究顯示，iPSCs能夠在AD模型中逆轉早期病理變化。在PD APP轉基因小鼠模型中，hiPSCs衍生的膽堿能神經元前體給藥會刺激內源性神經發生，并逆轉空間記憶損傷[50]。將hiPSCs-NSC移植到卒中小鼠的海馬中，可改善神經功能[51]。近幾年對干細胞移植到不同的AD大鼠和小鼠模型的分析顯示，這種方法對動物的記憶和學習恢復有積極的影響[52]。經iPSCs分化的神經球在移植到受損的小鼠脊髓后能夠存活并分化成神經細胞、星形膠質細胞和少突膠質細 胞[53]。電生理實驗和形態學觀察表明，移植的神經元可表達正常活性[46]。AD大鼠模型研究顯示，神經營養因子(如NGF)聯合NSC移植治療能夠增加其前腦膽堿能神經元和突觸的數量，顯著改善大鼠的學習和記憶能力[54]。

另外，移植的NSC在遷移和分化過程中也會受到受體大腦微環境的顯著影響。研究表明，人APP的過度表達可導致移植細胞產生更多的星形膠質細胞[55]，提示AD的發病過程可能對NSC移植的治療效果產生負面影響。大腦中有害的微環境也會使大量的移植細胞意外死亡，因此尋找一種支持細胞生長、神經元再生的方法極其重要。有研究發現，合成的聚脫氨基酪氨酸乙酯碳酸酯聯合iPSCs衍生的神經元接種于小鼠腦內，可有效刺激NSC的突觸重塑，促進神經細胞進入腦組織，種植在3D支架上的iPSCs在注射部位的存活率提高了約38倍，谷氨酸能和多巴胺誘導神經元以解離或微折疊形式共同移植到微支架上時，存活率也有類似的提高[56]。值得一提的是，生物材料與細胞共同移植的方法在AD的相關研究中應用較少，未來可考慮將其應用于AD的治療中。

3.2細胞移植存在的問題

3.2.1供體細胞 基于iPSCs的治療具有較低的免疫不相容性，但是fAD患者缺乏可用于重編程的健康體細胞，這一問題應該在治療中首先予以解決。Aβ沉積可能是AD治療的另一個障礙，而基于iPSCs的治療可以替代丟失的神經元并去除Aβ沉積。因此目前用于移植的干細胞需要達到良好制造規范的標準并允許應用于實驗研究，但需要一段時間才能產生用于臨床治療的優化供體細胞[57]。

3.2.2移植時間和位置 對于AD治療而言，除了優化供體細胞，細胞替代戰略也頗具挑戰性。AD的病理學特點使得我們很難確定移植的最佳時間和最佳位置。因為AD患者大腦中的多個區域受到了影響，包括顳葉、頂葉、額葉皮質[58]等。在疾病開始擴散之前，移植細胞可能對AD患者是有好處的，但由于AD的機制復雜，移植時間很難確定，且發病過程可能對NSC移植的治療效果產生負面影響[55]。而且，細胞外環境與細胞移植、存活和部分功能的恢復有關[59]。因此找到最佳位置對于治療AD至關重要。

4 藥物篩選

研究表明，由干細胞衍生的神經細胞具有高通量篩選(high-throughput screening，HTS)候選治療藥物的潛力，可以作為AD的理想細胞模型[60]。患者的iPSCs可以保留其基因型，更好地模擬神經系統疾病的表型，當其與HTS相結合時，可能為藥物毒性試驗創造更有利的條件[61]。

AD患者特異性iPSCs的神經元能夠用于測試并篩選γ-、β-分泌酶抑制劑和Aβ抗體等候選藥物，如PSEN2 iPSCs的神經元可對分泌酶抑制劑治療產生反應[62]。但在最近的臨床試驗中，γ分泌酶抑制劑的潛在類似物Semagacestat和Avagacestat對AD的治療無顯著效果[63-64]，后者甚至可導致認知衰退，與預期結果相反[63,65]。在研究APP V717I突變時發現，fAD神經元和sAD神經元都對另一種分泌酶抑制劑DAPT產生反應，并且用DAPT處理時，誘導的神經元會抑制Aβ38、Aβ40和Aβ42的生成，另外還發現一種能夠結合Aβ的抗體，可以阻止APP V717I神經元中總tau蛋白水平的增加，在臨床試驗中，該抗體成功地降低了Aβ肽的水平，但未能減緩認知障礙的進展[40]。此外，二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)能改善雌激素受體應激或抑制活性氧生成[66]。具有APP-E693δ突變的神經元經DHA處理后，存活時間更長，但研究顯示DHA治療只能緩解癥狀，不能作為一種預防方法[67]。除了表型篩選，iPSCs還可基于目標來篩選潛在的候選藥物[68]。研究人員通過AD患者衍生的iPSCs模型鑒定了一種相關疾病蛋白——胞外tau蛋白(extracellular tau，eTau)，并開發了一種針對該蛋白的治療抗體[69]。此外，特定疾病的iPSCs模型也可將藥物重新定位，從而發現該藥物在其他疾病中的應用。研究者發現抗癲藥物ezogabine可以在ALS的iPSCs模型中產生療效，在這項研究中，ezogabine對伴隨超氧化物歧化酶1基因突變和其他基因突變(如C9ORF72)的ALS患者的iPSCs模型產生了影響[70]。

最近開展了一項通過電子分析篩選新藥的研究，利用AD-iPSCs衍生的NP模型和神經元模型，以L1000FWD軟件分析鑒定具有抗特征基因干擾譜的藥物，發現iPSCs衍生的NP和神經元對環孢素A的預測結果一致[44]。新藥開發成本較高，因為候選藥物可能會在后期的臨床試驗中出現一些意料之外的不良反應，從而導致研發失敗。而iPSCs技術在藥物篩選方面不僅節約了成本，也為新藥開發、藥物毒性檢測等提供了更為有效的平臺。

5 總結與展望

AD患者特異性iPSCs提供的獨特平臺能檢測神經發生過程中的早期疾病表型，并且能根據復雜的表型結合高通量篩選為藥物毒性檢測提供一種高效的方法，這為研究AD的潛在致病機制和篩選新藥提供了技術支撐。在伴有APP、PSEN1和PSEN2突變的AD患者中，iPSCs技術為單基因疾病提供了一種潛在的治療方法，通過糾正這些突變可為最終治療AD提供幫助。這項技術不僅克服了從AD患者身上獲取活神經元的困難，也克服了不能模擬偶發性AD的困難[46]。iPSCs與其他細胞共培養獲得3D類器官模型的研究也為治療AD開拓了新的思路[71]。隨著對AD發病機制認識的不斷深入，未來有望開發出對不同發病機制患者均可發揮作用的藥物，并可探索抗AD藥物聯合用藥的可行性。