Fas凋亡途徑在椎間盤退變中的作用研究進展

胡一村，張曉勃，張芮浩，陳祥義，于得臣，王克平，周海宇*

1蘭州大學第二醫院骨科，蘭州 730030；2甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室，蘭州 730030；3蘭州市西固區人民醫院骨科，蘭州 730060

慢性下腰痛已成為當今世界嚴重的醫學和社會問題，是導致中老年人殘疾的重要原因[1]。作為慢性下腰痛最常見的病因，椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)困擾著全世界40%～45%的人口，其中60歲以上成人患病率高達68%[2-3]。目前IDD的臨床治療手段包括手術和非手術治療，其中手術(如經皮穿刺椎間盤減壓、腰椎椎體間融合術、人工椎間盤置換等)依然是主要的治療方式，但不能從根本上去除病因，且存在高侵襲性和高復發風險，甚至可加重現有損傷。因此，迫切需要尋找一種新型療法以改變現狀。近年來，基因靶向療法受到廣泛關注[4-5]，可顯著降低患者的手術風險，減少術后并發癥，甚至有望逆轉IDD的進展[6-7]。 Fas信號轉導通路作為細胞凋亡的經典途徑，對細胞增殖和凋亡的平衡有著重要意義[8]。最近研究發現，Fas信號通路激活是導致IDD惡化的重要因素，通過技術手段抑制椎間盤內Fas信號通路可能是一種有效的治療方法。本文綜述近年來Fas凋亡通路與IDD發生機制的最新研究進展，概括總結既往研究存在的局限，以期為基因治療應用于臨床提供 基礎。

1 Fas凋亡通路

細胞凋亡不同于程序性細胞死亡，因為細胞死亡可發生在生理發育過程中，且表現為非凋亡特征[9]。椎間盤細胞凋亡是引起IDD的重要機制[10]，其凋亡途徑可歸納為死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網應激途徑。死亡受體途徑是指促進細胞凋亡的各種外部因素通過不同的死亡受體信號系統介導細胞凋亡，屬于外源性凋亡信號通路[11]；內源性凋亡信號通路起源于線粒體，與B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族的激活有關，凋亡關鍵分子是半胱天冬酶-9(caspase-9)，這兩種信號通路在髓核細胞凋亡過程中扮演著重要角色[12]。研究發現，Fas可分別通過死亡受體途徑和線粒體途徑兩種方式參與IDD的發生[13]。

1.1 Fas/FasL分子結構 Fas又稱Apo-1、CD95或TNFSF6，最初由Yonehara等[14]在一種誘導細胞凋亡的單克隆抗體中發現，其基因位于人類染色體10q24.1或10q23，跨越約23.5 kb[15]。Fas可廣泛表達于各種組織，但主要集中在胸腺、肝臟和腎臟[16]。Park等[17]在腰椎間盤細胞內發現了Fas的表達，且表達程度因椎間盤突出類型不同而不同，這為Fas凋亡途徑在IDD中的作用研究奠定了重要基礎。Fas的配體FasL(又稱CD95L、CD178)于1993年由Suda等[18]從細胞毒性T細胞雜交瘤PC60-d10S細胞系中成功克隆，屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族，在細胞中以膜結合(mFasL)和可溶性(sFasL)兩種形式存在[19]。

1.2 Fas/FasL介導細胞凋亡 Fas凋亡途徑是死亡受體信號通路的關鍵要素，也是調控細胞凋亡的主要途徑[20-21]。FasL誘導Fas三聚體的形成，后者招募并與細胞質銜接蛋白的N端死亡域、Fas相關死亡域(FADD)結合，將凋亡信號傳遞給半胱天冬酶原-8(procaspase-8)[22]，隨后，Fas-FasL-FADDprocaspase-8共同組成死亡誘導信號復合物(deathinducing signaling complex，DISC)[23]。半胱天冬酶家族的成員是關鍵的效應分子，其中半胱天冬酶-8(caspase-8)是啟動因子，在死亡受體介導的細胞凋亡中起頂體蛋白酶的作用[24]。Caspase-8激活后可激活下游的效應蛋白半胱天冬酶-3(caspase-3)，導致蛋白酶水解及引起一系列的酶聯反應，最終使DNA降解，誘導細胞凋亡[25]。

2 IDD的病因

IDD的分子機制十分復雜，目前其病因及發病過程尚未完全闡明。現有證據表明，IDD與生物力學因素、炎性因子破壞、細胞凋亡、酶活性變化和易感基因的影響等有關[26]。細胞凋亡學說是近年來的研究熱點，作為經典凋亡途徑，Fas通路引起的椎間盤細胞凋亡是椎間盤變性的重要原因[27]。IDD發生時，椎間盤表現為蛋白多糖含量降低、髓核水分減少、髓核細胞凋亡及細胞外基質分解等變化。

正常人體椎間盤處于低氧、低營養、高滲透壓、高機械強度的環境下，椎間盤內這種微環境的變化是誘導IDD的重要原因。研究發現，低氧誘導因子-1α在髓核中大量表達，在髓核細胞適應低氧環境時發揮重要作用[28-29]。也有研究發現，低氧誘導因子與椎間盤髓核細胞的凋亡呈正相關[30]，這與低氧環境下低氧誘導因子對椎間盤的保護作用不符，因此筆者推測兩者之間可能存在一定的負反饋調節，需要進一步研究加以驗證；而Fas凋亡通路的關鍵分子可作為檢測細胞凋亡的重要指標。此外，椎間盤內的低營養和異常生物力學因素也是導致IDD的重要原因[31-32]。研究發現，低營養可誘導椎間盤纖維環細胞自噬[33]，激活髓核細胞的線粒體凋亡通路[34]，從而引起IDD。雖然目前生物力學因素引起IDD的具體機制尚不明確，但學者們一致認為細胞外基質合成減少及細胞衰老死亡是其主要原因[35]。目前，IDD的具體作用機制和信號通路研究較少，但椎間盤細胞凋亡可能是IDD的重要起始因素，Fas凋亡通路在其中的作用需要更深層次的探索。

3 Fas凋亡通路與IDD的關系

當細胞外部環境發生變化或由于某種內部因素激活Fas通路時，可誘導IDD的發生。有研究發現，軟骨終板細胞凋亡與IDD的發病機制有關。在人類退化的軟骨終板細胞中，miR-34a表達水平明顯升高，且伴有凋亡增加。體外敲除人軟骨終板細胞中的miR-34a可導致Bcl-2蛋白過表達，而上調miR-34a可抑制Bcl-2的表達，提示miR-34a可通過靶向抑制Bcl-2促進軟骨終板細胞凋亡，從而促進退變的發生[36]。 此外，Fas通路激活可促進纖維環細胞凋亡，從而導致椎間盤變性的發生[37]。IDD與Fas通路存在密切聯系，有必要進一步研究Fas凋亡通路在IDD中的作用機制。

3.1 Fas/FasL基因多態性與IDD的關系 目前，Fas是誘導IDD的重要原因已達成共識，但FasL的作用仍存在爭議。多數學者認為，FasL在退變椎間盤中的表達呈下降趨勢，髓核細胞表達的FasL對椎間盤具有保護作用[38]。Huang等[39]采用人類病例對照研究Fas/FasL基因多態性與IDD的關系，結果顯示，Fas的G等位基因(rs1800682)與IDD發病風險增加有關，FasL的T等位基因(rs763110)與所有模型中IDD的發病風險降低有關。但也存在不同的觀點，即FasL的表達對椎間盤有損害作用。如Han等[40]認為，FasL能通過上調髓核細胞中Fas的表達而促進髓核細胞凋亡，且凋亡與FasL呈劑量依賴性。Zhu等[41]對348例IDD患者和215名健康者進行基因分型，發現Fas 1377G/A和FasL 844C/T多態性與中國漢族人群IDD的嚴重程度有關。有研究報道，FasL和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的遺傳多態性與中國漢族人群IDD的易感性明顯相關[42]。因此，FasL在IDD中的作用仍未完全闡明，需要深入研究FasL與IDD的關系及其作用機制。

3.2 Fas/FasL與IDD炎性因子的關系 炎癥是導致IDD的重要因素，目前已知的IDD相關炎性因子包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、前列腺素E2、環氧合酶-2、HIF-1α等[43]。有研究發現，人髓核細胞中的IL-2可通過激活Fas死亡受體通路促進細胞凋亡[44]。Yamamoto等[45]利用人椎間盤髓核永生化細胞系與巨噬細胞系共培養，發現髓核永生化細胞系可產生促炎細胞因子，而FasL在髓核細胞產生促炎細胞因子的過程中發揮重要作用，與Yoshida等[46]在兔椎間盤的體外研究結果一致。轉化生長因子-β1(TGF-β1)具有再生椎間盤的潛力，Xie等[47]發現，TGF-β1可顯著抑制大鼠髓核細胞的凋亡，降低caspase-3和caspase-8的活性。因此，TGF-β1可通過Fas死亡受體通路延緩IDD的進展，IDD炎性因子與Fas凋亡通路可能具有協同作用，抑制Fas通路可能會間接抑制椎間盤內的炎癥反應，這為IDD的治療提供了新的思路。

3.3 Fas/FasL與IDD免疫反應的關系 纖維環、軟骨終板及免疫分子共同組成血髓核屏障。正常狀態下，髓核與宿主的免疫系統處于隔離狀態。當纖維環破裂或其他因素導致髓核組織暴露于自身免疫系統時，保護屏障被損壞，機體激活T細胞、B細胞引起自身免疫反應。髓核在免疫應答中逐步發生級聯反應，這在IDD的發生發展中發揮著重要作用[48]。 既往研究發現，Fas凋亡通路參與了機體的免疫反應[49]。此外，Fas介導的細胞凋亡受免疫分子和信號通路調控[50]。因此，Fas信號通路與免疫相關性IDD存在密切聯系。

人體椎間盤是免疫特權器官，可通過Fas-FasL調節機制與侵入性免疫細胞相互作用。人類髓核細胞具有多種多樣的細胞形態，能夠合成細胞外基質成分，表達Fas和FasL作為重要的免疫特權位點。FasL功能障礙是IDD的重要特征，此時，髓核細胞與免疫細胞之間的相互作用失衡[51]。而可溶性Fas的增加則可抵消FasL的影響，通過破壞髓核的免疫平衡和增加免疫細胞浸潤導致IDD[52]。當FasL過表達時，髓核細胞中的巨噬細胞和CD8+T細胞凋亡率增高[38]，并可誘導侵襲性Fas陽性細胞激活的細胞毒T淋巴細胞凋亡[53]。綜上，FasL在人椎間盤免疫特權中發揮重要作用，有助于維持髓核的免疫 特權。

干細胞移植可使變性的椎間盤再生，與Fas-FasL途徑和免疫細胞相互作用獲得特權以及增強免疫力有關[51]。但有學者認為，IDD發生時機體免疫反應并沒有明顯的利弊之分，這對IDD發生時機體的免疫作用提出了質疑[54]。筆者認為，正常情況下免疫反應對機體具有保護作用，當IDD發生時，髓核等化學物質暴露于免疫系統下，免疫反應可引起其他的連鎖損傷，這可能是機體的一種警示信號，但對機體造成了重大損害。目前IDD免疫與Fas凋亡途徑的關系尚未完全闡明，加深對免疫特權的認識有可能為治療IDD提供新的靶點。

3.4 Fas/FasL與IDD血管生成的關系 椎間盤是人體最大的無血管器官。隨著IDD的惡化，椎間盤逐漸被血管化。已知人髓核細胞和血管內皮細胞均表達Fas和FasL。IDD過程中存在多種血管生成機制，這些血管的生成與Fas/FasL的表達存在一定關聯。研究發現，內皮細胞表達的Fas具有促進和維持血管完整性的作用[55]。Sun等[56]建立髓核細胞與血管內皮細胞共培養系統，發現正常髓核細胞誘導血管內皮細胞凋亡的能力強于退化的髓核細胞；FasL可介導下游FADD和caspase-3的激活，使血管內皮細胞凋亡，從而防止椎間盤血管再生。血管內皮細胞凋亡可導致終板微血管密度降低，影響IDD的病理過程[57]。因此，人髓核細胞可誘導內皮細胞凋亡，并抑制內皮細胞的遷移。但隨著年齡增長，髓核細胞不斷衰老，其誘導凋亡的能力不斷下降，由此導致的椎間盤微環境變化可能是IDD血管異常長入的重要因素[58]。因此，Fas凋亡通路在IDD晚期血管異常長入變性椎間盤的過程中發揮著關鍵作用，且可能是通過與內皮細胞相互作用實現的。

4 靶向抑制Fas通路在IDD治療中的作用

4.1 藥物靶向抑制Fas通路 靶向抑制Fas凋亡通路可能是減緩IDD進程的有效方法。有研究發現，芍藥苷對細胞具有保護作用，可抑制大鼠椎間盤Fas通路的激活，減少FasL誘導的纖維環細胞凋亡[37]。 Erwin等[59]發現，脊索細胞(椎間盤前體細胞)分泌的因子可通過抑制活化的caspase-9、caspase-3和caspase-7的表達而抑制髓核細胞死亡，并通過促進細胞外基質的合成而保護椎間盤髓核。研究發現，在IDD過程中，纖維環細胞中胰島淀粉樣多肽(IAPP)的表達明顯降低，慢病毒si IAPP轉染可降低IAPP及其受體的表達，下調IAPP可誘導纖維環細胞中活性氧(ROS)的產生，使基質金屬蛋白酶表達減少，細胞內Ca2+濃度增加，最終導致細胞死亡；si IAPP干預可促進線粒體中細胞色素C的釋放，導致caspase-3和caspase-9激活，此外還可誘導Fas/FasL系統的激活和細胞死亡[60]。因此，IAPP表達下調可通過線粒體和死亡受體兩種途徑誘導纖維環細胞死亡，參與IDD的進展。綜上，芍藥苷、脊索細胞分泌的因子以及上調IAPP等可能為一種有效的治療策略，但需要臨床試驗驗證其有效性及可行性。

4.2 RNA靶向抑制Fas通路 RNA靶向治療是近年來研究的熱點。通過RNA靶向抑制Fas凋亡通路可有效減緩IDD。Cui等[61]對66例IDD患者和58名健康志愿者的血清進行實時定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting檢測，結果顯示，長鏈非編碼RNA(lncRNA) MAGI2-AS3可抑制FasL的表達，沉默lncRNA MAGI2-AS3可促進髓核細胞中FasL的表達。另有研究報道，Fas小干擾RNA(siRNA)治療椎間盤細胞凋亡的功效(約10%)優于神經生長因子(PDGF)和胰島素樣生長因子1(IGF-1)(分別為2%和5%)[62]。siRNA介導的Fas表達抑制可增強細胞增殖活性(約21%)，在凋亡起始階段，Fas表達下調可抑制細胞凋亡并誘導細胞增殖，從而增強椎間盤細胞的活力[63]。 因此，Fas siRNA可能是治療IDD的有效方法，在RNA水平抑制Fas通路以減緩退變的發生具有一定可行性。

Wang等[53]采用慢病毒攜帶miR-155前體轉染髓核細胞，轉染后髓核細胞的FADD和caspase-3表達受到抑制，敲除miR-155后FADD和caspase-3過表達，表明miR-155可負調控Fas通路的表達。Zhang等[64]收集脊柱側彎患者和IDD患者的髓核樣本，用慢病毒攜帶miR-210前體(pre-miR-210)和antago miR-210轉染實現髓核細胞miR-210的過表達和敲低，結果顯示，IDD患者miR-210的表達低于側彎對照患者，miR-210表達下調促進了Fas介導的髓核細胞凋亡；pre-miR-210治療后凋亡的髓核細胞比例明顯降低，提示miR-210可能是IDD治療的新靶標。此外，Li等[65]發現，miR-129-5p對IDD具有保護作用，上調miR-129-5p可促進大鼠髓核細胞的增殖，降低FADD的表達，抑制細胞凋亡。另有研究報道，RNA干擾是一種局部治療IDD的方法[66]。綜上，抑制Fas凋亡通路可能是抑制IDD進展的有效方法，這為其靶向治療提供了新的思路，但以上研究存在一定的局限性：IDD的病因、機制尚未完全闡明，疾病治療缺乏特異性；未觀察到細胞凋亡和增殖的可比變化，缺乏說服力；細胞代謝和活性以及產生細胞外基質的能力仍然是椎間盤修復的關鍵指標，但多數研究未能證實；治療方案多處于動物和人體外實驗階段，缺乏足夠的臨床依據證實臨床應用的可行性及有效性。

5 總結與展望

綜上所述，靶向治療IDD是未來發展的趨勢，其中Fas通路可能是靶向治療IDD的新靶點。雖然目前的研究存在一定的局限性，但攜帶基因藥物或RNA靶向抑制Fas通路可能是IDD的理想治療方法。載體構建一直是基因靶向治療所面臨的重要挑戰，最近研究發現，外泌體可作為有效載體用于靶向治療疾病且無明顯細胞毒性，因此，選用外泌體攜帶治療因子轉移到受損的椎間盤細胞從而減緩IDD可能是一種有效的治療手段。