單細胞測序在三陰性乳腺癌新輔助化療中的應用研究進展

胡喜娥，楊振宇，薛景毅，楊 平，彭書甲，袁利娟，包國強

1.空軍軍醫大學第二附屬醫院普通外科，陜西 西安 710038；2.陜西中醫藥大學第二臨床醫學院，陜西 咸陽 712000

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指缺乏雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達的一類乳腺癌亞型，占乳腺癌患者總數的12%～18%［1-2］。相對于乳腺癌其他亞型，TNBC患者在診斷時原發腫瘤大，惡性程度高。由于缺乏相關治療靶點，TNBC對激素療法和靶向治療都不敏感，目前采用以化療為主的全身治療方案。其中新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）是伴有較高腫瘤負荷的TNBC患者的首選治療方案［3］。但約有50%的TNBC患者對NAC表現出耐藥性，導致該疾病整體的難治性［1，4］。

有研究［5-8］表明，TNBC患者存在高水平的體細胞突變、TP53頻繁突變以及復雜的非整倍體重排，導致廣泛的瘤內異質性。以往關于TNBC患者化療耐藥性的研究僅基于靶向標志物或高通量基因組的組織分析，而且在化療期間重建克隆進化的能力有限［5，9］。近年來，隨著高通量測序時代的來臨，單細胞測序（single-cell sequencing，SCS）技術不斷發展，逐漸成為一種研究TNBC腫瘤復雜性的理想方法。SCS可獲得單個細胞基因組、轉錄組和表觀遺傳學信息，從而可以有效地識別單個腫瘤細胞產生的獨特突變表型，是解決瘤內異質性、重建進化譜系和檢測稀有亞種群的強大工具，為提高TNBC的精準治療水平提供了新思路［10-11］。

1 SCS概述

與傳統高通量測序技術分析細胞整體性特征信息不同，SCS技術是在單個細胞基礎上實現對基因組、轉錄組和表觀遺傳組等的高通量測序分析，從而能夠剖析單個細胞基因表達的動態信息，揭示不同細胞的差異和進化關系［12-13］。由于組成生物機體的每個細胞都是獨一無二的，傳統的高通量測序通過檢測混合樣本中集合細胞的平均基因表達情況，只能粗略地揭示細胞間的生物學差異，因此可能掩蓋了一些關鍵基因表達變化及細胞具體分化機制，不利于一些生物學變化過程中詳細機制的研究。而SCS技術很好地解決了這一問題。因此，利用SCS技術可以幫助我們更好地解釋機體精細變化的分子機制，為傳統的生物學研究提供新的視野。目前，SCS主要分為單細胞基因組測序、轉錄組測序、表觀遺傳學測序及多組學測序；其具體流程包括單細胞分離捕獲及測序與數據分析。

1.1 單細胞分離捕獲

單細胞分離捕獲是SCS的首要步驟，也是SCS成功的關鍵。單細胞分離捕獲的方法主要包括連續稀釋法、單細胞顯微鏡操作法、流式細胞術（flow cytometry，FCM）、微流控技術、激光捕獲顯微切割術（laser-capture microdissection，LCM）等［14-20］，這些方法大多數都需要從新鮮的癌癥組織中制備細胞懸浮液。不論起始樣本如何，制備高質量的單細胞懸浮液對于單細胞分離捕獲及后續的序列擴增與測序至關重要。

1.2 SCS

1.2.1 單細胞基因組測序

單細胞基因組測序需要在分離得到的單細胞中提取DNA，然后對提取到的DNA進行進一步的全基因組擴增（whole-genome amplification，WGA），再通過DNA二代測序技術進行測序分析，最終檢測出多種不同類型的基因改變。WGA的主要方法包括多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）、退行性寡核苷酸聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和多重退火環狀循環擴增等。其中，MDA由于對全基因組的覆蓋率高，因此多用于單核苷酸突變的檢測，而后兩者對基因組擴增的均一性好，對大于1 Mb拷貝數變異的檢測具有更高的靈敏度和特異度［21-22］。

1.2.2 單細胞轉錄組測序

單細胞轉錄組測序可直觀地反映基因的表達情況，能更準確地辨別處于不同狀態或發展階段的細胞。具體方法為：在單細胞分離和RNA提取后，先將捕獲的mRNA反轉錄為cDNA，再用PCR或體外轉錄的方法進行全轉錄組擴增，最終進行測序分析。主要方法包括：Tang法、5’末端轉換的RNA轉錄本測序、Quartz測序法（Tang法的簡化和改進版本）、細胞表達的線性擴增測序、單細胞標記反轉錄測序、數組基和乳化基測序法等［23］。由于每個單細胞都有成千上萬份mRNA轉錄本，而染色體DNA分子只有2份，因此單細胞RNA測序的發展相較于DNA測序已取得顯著進展。

1.2.3 單細胞表觀遺傳學測序

表觀修飾包括DNA甲基化、羥甲基化、非編碼RNA調控、組蛋白修飾、染色質重構及與染色質結合的結構調節蛋白等［24］。除基因組本身以外，其表觀修飾也對基因表達調控起著重要作用，尤其是DNA甲基化。目前，DNA甲基化可以用多種方法繪制全基因組圖譜，如甲基化特異性限制性內切酶、親和純化以及單細胞簡化代表性亞硫酸氫鹽測序法（single-cell reduced-representation bisulfite sequencing，scRRBS）等，其中，scRRBS已被廣泛用于單細胞DNA甲基化的研究中，因其允許單堿基分辨率和DNA甲基化水平的絕對定量，被認為是金標準［25］。

1.2.4 單細胞多組學測序

單細胞多組學測序為研究實體瘤發生、發展過程中的各種分子機制以及進一步探討各細胞基因組、轉錄組和表觀遺傳學三者之間的關系提供了極大幫助。Hou等［26］開發了一種單細胞三重組學測序技術，可同時分析單個哺乳動物細胞的基因組拷貝數變異以及DNA甲基化組和轉錄組信息，為分析基因組和表觀基因組異質性對細胞群中轉錄組異質性的復雜貢獻提供了新途徑。Macaulay等［27］利用G&T-seq（一種從單細胞分離和測序基因組DNA和全長mRNA的方法），對來自小鼠和人類的220多個單細胞平行測序，最終同時獲得了單個細胞的基因組和轉錄組信息。

2 SCS在TNBC的NAC中的應用

NAC最初僅用于局部進展期或炎性乳腺癌，而現在用于可手術的患者中，特別是在TNBC患者中更為常見。NAC使患者能夠進行保乳手術，實時監測治療反應，有利于在術前評估個體腫瘤的化療敏感性；NAC過程中還可以同時添加其他系統性療法以改善治療效果并預測未來復發風險；此外，以原發性腫瘤對NAC的反應特性作為主要結果的臨床試驗設計加速了新藥的評估和批準［28］。因此，在如今強調個體化治療的時代，NAC在TNBC中的意義愈發突出。

有研究［29］表明，約2/3的局部TNBC患者在NAC后出現殘留疾病，復發風險很高。如何優化化療應用是TNBC研究領域的重要課題之一。TNBC患者NAC耐藥性的基因組和分子基礎至今尚不明確，部分原因可能是缺乏在罕見亞群中檢測及分析基因組信息的方法。因此，SCS技術由于前文所述優點，或可成為解決這一難題的有力工具，其具體應用前景有以下幾個方面。

2.1 確定腫瘤亞型，分群精準治療

目前在TNBC的NAC領域一個重要課題就是如何在達到最大治療效果的同時盡可能地減少不必要的治療及藥物不良反應，從而使患者真正受益。腫瘤的異質性是指腫瘤細胞增殖過程中不同時間、空間細胞遺傳物質在復制、轉錄和翻譯的不同層面發生變化，導致子代細胞在基因型和表型中均存在差異，從而促進腫瘤的進化［30］。根據乳腺癌ER/PR/HER2表達譜及Ki-67標記指數的不同，共分為5個亞型；而TNBC是所有亞型中突變數量最多的、具有廣泛瘤內異質性的腫瘤。

NAC后未達到病理學完全緩解的TNBC患者預后通常較差，可能與存在少數對傳統化療不敏感的TNBC細胞亞群有關，從而導致后續轉移［4］。Navin等［19］應用SCS對2例乳腺癌患者腫瘤中的100個單細胞進行分析，發現了3個不同的單克隆亞群，其中1個擴增形成了原發腫瘤并由此導致播散轉移，該研究表明，乳腺癌的生長是由于不間斷地克隆擴增造成的。正是因為乳腺癌不同克隆亞群的不間斷生長，使得乳腺癌分化出不同的亞型。因此，運用SCS技術精準識別和表征這些不同的細胞亞型，可以監測和指導TNBC靶向治療，從而有助于生存率的提高。

此外，SCS能夠發現具有潛在治療靶點的細胞亞群，在促進個體化治療方面是一種很有前景的工具。來自哈佛大學醫學院的研究小組［31］應用單細胞圖譜發現了TNBC的亞克隆異質性和侵襲性疾病狀態，研究人員通過對未治療的原發性TNBC的腫瘤細胞進行單細胞RNA測序，證實其具有細胞異質性，并通過聚類分析確定了5個不同的上皮細胞簇；其中第2簇具有較高的增殖能力，進一步研究表明，該細胞簇與乳腺癌細胞起源的管腔祖細胞特征相關，是一類惡性細胞亞群，其快速增殖可能驅動腫瘤進展，從而導致TNBC較差的生存結果。另外，Chung等［32］利用單細胞轉錄組測序技術對11例乳腺癌患者的515個細胞進行研究，發現乳腺癌細胞在不同亞型和關鍵的癌癥相關通路上表現出瘤內異質性。

上述證據表明，SCS技術有助于加深我們對于TNBC腫瘤異質性的理解，能夠在TNBC的NAC前發現瘤體中可能存在的惡性程度不同的腫瘤亞型以指導精確診斷，不僅有助于實現不同亞型的患者分類，選擇NAC受益群體，而且還可能為預后不良的TNBC患者提供潛在的預測因子或治療靶點，從而有效指導TNBC的精準治療。

2.2 揭示耐藥機制，監測藥物反應

TNBC是一種侵襲性亞型，容易對化療產生耐藥性，使其治療面臨重大挑戰。目前該領域有一個尚未解決的問題，即化療耐藥是由于先前存在的稀有亞克隆的選擇和適應而產生的（適應性耐藥），還是通過誘導新突變而產生了新的化學耐受表型（獲得性耐藥）。這個問題已經在細菌系統中研究了幾十年，但在大多數人類癌癥中仍然知之甚少。

SCS的結果強調了腫瘤內遺傳異質性在腫瘤發展進化中發揮重要作用，并表明未經治療的腫瘤內遺傳異質性是腫瘤耐藥的關鍵因素［30，33］。Kim等［34］應用單細胞DNA和RNA測序分析了20例在NAC期間的TNBC患者的縱向樣本，發現TNBC耐藥基因型是先前存在的，并且是由NAC自適應選擇，而TNBC患者化療后可自適應地發生基因組突變和拷貝數畸變，并通過轉錄重編程進化出耐藥表型，該研究通過SCS技術表明，TNBC患者的耐藥模型是由適應性耐藥與獲得性耐藥共同建立。因此，運用SCS技術有助于揭示TNBC在NAC中的耐藥發生機制，從而指導臨床醫師及時調整NAC方案，使TNBC患者獲得最佳治療效果。

此外，Lee等［35］將單細胞轉錄組測序技術分別應用于未經化療、對紫杉醇化療敏感以及對紫杉醇化療耐藥的轉移性乳腺癌中進行研究，結果顯示，耐藥細胞含有38種特定的變異RNA，后者參與微管穩定、細胞黏附和細胞表面信號轉導，且耐藥細胞的基因表達譜與未處理細胞相似，只是在數量上翻了幾番。因此，SCS技術對于揭示細胞在藥物刺激下動態的應激反應機制具有巨大潛力。

以上研究表明，SCS技術不僅可闡述腫瘤的耐藥機制，解釋部分TNBC患者NAC失敗和復發的原因，還預示著耐藥TNBC患者進一步治療的潛在可能，提示SCS技術的應用可為TNBC患者NAC耐藥的檢測與評估開辟新道路，對于NAC過程具有重要意義。

2.3 闡明轉移機制，發現治療靶點

TNBC是一種高侵襲性和轉移性的乳腺癌亞型，多項研究［36-38］表明，該亞型的患者在一線治療后有頻繁轉移和高復發率。探索和闡明乳腺癌腫瘤細胞轉移機制、發現NAC新靶點一直都是該領域研究者不遺余力追求的目標，而SCS技術或可為其提供有力工具。

乳腺導管原位癌（ductal carcinomain situ，DCIS）是一種早期乳腺癌，僅10%～30%的DCIS病例會進展為浸潤性導管癌（invasive ductal carcinoma，IDC）［39］。在分析DCIS患者大塊組織樣本的研究中很難精確區分克隆譜系。Casasent等［40］在2018年開發了一種結合激光彈射的單細胞DNA測序方法，將其應用于10例同時患有DCIS和IDC患者的1 293個單細胞中，最終發現原位癌與侵襲性癌各亞群之間存在直接的基因組譜系，大多數突變和拷貝數畸變于侵襲前就在導管內完成了進化。Aceto等［41］將單細胞RNA測序用于乳腺癌骨轉移患者的外周血循環腫瘤細胞分析中發現，雄激素受體（androgen receptor，AR）的剪接變異體AR-v7可組成性地激活AR信號通路，在乳腺癌骨轉移過程中發揮重要作用，因此推斷轉移性乳腺癌患者可能受益于AR靶向治療。

以上研究表明，SCS技術不僅有助于發現TNBC侵襲和轉移中的亞克隆細胞群，還有利于探究有關其轉移的潛在分子機制，發現NAC中新的有效靶點，有望為TNBC患者的NAC帶來新的突破。

2.4 探究免疫進化，評估治療效果

乳腺癌中腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）的種類和數量是改善患者生存的一個強有力的預后因素，特別是在TNBC中，TIL更具有療效預測作用［42］。Azizi等［43］對來自人類乳腺癌中的6 311個T淋巴細胞進行了單細胞RNA測序，結果表明，具有大量TIL的乳腺癌含有具有組織駐留記憶T（tissue-resident memory T，TRM）細胞分化特征的CD8+T細胞，這些CD8+TRM細胞表達高水平的免疫檢查點和效應蛋白，與早期TNBC患者的生存改善顯著相關。進一步了解TRM細胞的發育、維持和調控將是TNBC免疫治療成功的關鍵，而SCS技術在其中的應用顯示出巨大潛力。

因此，SCS有助于更全面地了解免疫微環境在TNBC腫瘤進化中的作用，探索腫瘤相關免疫細胞中較為關鍵的突變基因和表面標記，從而便于發現TNBC的NAC過程中應用免疫相關制劑的新靶點；同時，臨床上利用SCS技術對腫瘤免疫微環境進行分析，以評估患者免疫治療效果［44］，協助制定新的免疫治療反應評價標準，由此或可推動TNBC個體化治療進入新階段。

3 結語與展望

SCS領域正在快速發展，為我們從單個細胞的精細角度了解腫瘤的遺傳、變異、發生、發展、侵襲和轉移等提供有力武器，對生物醫學的發展和進步發揮重要作用。尤其在乳腺癌精準化、個體化治療方面顯示出廣闊的應用前景，對TNBC的NAC發展進步更具深遠意義。但是，任何一項技術都有其優勢與不足，SCS技術及其衍生的相關技術也存在一定缺陷。首先，在單細胞分離提取過程中，準確篩選目標細胞且防止被污染仍然是一個挑戰，且各單細胞分離技術都或多或少存在弊端，需要改善和提升的空間還很大。其次，在目標分子擴增和測序過程中，覆蓋范圍不均、噪音的存在、測序數據定量不準等時有發生。此外，雖然SCS技術為TNBC患者NAC療效監測帶來了福音，但由于生物信息學分析的驚人成本及高昂價格，使已經承受著沉重疾病負擔的患者更加難以接受，從而在一定程度上限制了該技術在臨床上的廣泛應用。因此，SCS作為一項新興技術目前尚面臨著一些挑戰，但相信在不久的將來，SCS技術將能夠攻破上述難題，真正造福于所有TNBC患者。