蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白治療膠原誘導性關節炎大鼠的相關作用機制研究

陳妙月 丁興紅 吳素玲 陳俊松

祖國傳統醫學中蘄蛇又名尖吻蝮，具有驅風邪、通經絡等諸多功效，被證實是治療風濕痹證的要藥，蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白（typeⅡ collagen,CⅡ）是其主要有效活性成分。膠原誘導性關節炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠模型是以慢性、多發性末端關節炎，甚至關節損害等為主要表現的免疫性炎癥模型，被應用于關節炎病理生理、免疫機制的研究，以尋求新的治療靶點和驗證新的藥物療法[1]。本文建立CIA大鼠模型，以探討蘄蛇CⅡ治療CIA大鼠的相關作用機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 10周齡、清潔級Wistar雄性大鼠60只，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供；體重（286.5±4.3）g，飼養在標準環境中。

1.2 藥物與試劑 弗氏完全佐劑，采用20 ml弗氏不完全佐劑與200 mg卡介苗（批號：200703001，上海生物制品研究所）充分混合制成；蘄蛇CⅡ，采用胰蛋白酶組合微透析等技術從蘄蛇粉末（去內臟、皮骨）中分離提取并用0.9%氯化鈉溶液溶解獲得20、10、5μg/ml的溶液；塞來昔布（國藥準字：J20140072，輝瑞制藥有限公司），按36μg/g稱取藥物溶解于0.9%氯化鈉溶液中，獲得3.5 mg/ml的溶液。Bovine TypeⅡ Collagen購自美國 Chondrex公司，FBS購自美國 Gibco公司，ConA購自上海源葉生物科技有限公司，D-Hank's液、DMEM、IL-2、IL-4、IL-17、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的ELISA試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，FITC標記的抗大鼠CD4抗體、PE標記的抗大鼠CD25抗體、FITC標記的抗大鼠CD4抗體、PE標記的抗大鼠IL-17A抗體均購自杭州聯科生物技術股份有限公司，Percoll細胞分離液購自美國GE公司。

1.3 動物分組與處理 按隨機數字表法將60只大鼠分為6組，每組10只，即高劑量組、中劑量組、低劑量組、空白組、模型組、塞來昔布（對照）組，每組10只。在大鼠右后足爪皮下和尾根部注射牛CⅡ-弗氏完全佐劑乳劑（將弗氏完全佐劑加入等體積的Bovine TypeⅡCollagen中冰浴研磨均勻制成）0.2 ml建立CIA大鼠模型[2]，1周后尾根部追加0.2 ml進行免疫增強；而空白組注射等量的0.9%氯化鈉注射液。2周后采用灌胃方式給予藥物治療：高劑量組、中劑量組、低劑量組按10 ml/kg分別給予 20、10、5μg/ml的蘄蛇 CⅡ溶液，對照組按10 ml/kg給予塞來昔布溶液，其余兩組按10 ml/kg給予等量的0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續給藥30 d。治療結束后處死大鼠，獲得左后足膝關節滑膜組織和腸系膜淋巴結。

1.4 大鼠關節滑膜組織病理學觀察 采用HE染色法。取左后足膝關節滑膜組織，經甲醛固定、乙醇梯度脫水、制作石蠟切片、HE染色后在顯微鏡下觀察。采用0～4級評分法評價滑膜病變程度：正常表現為0級；輕微炎癥反應，可見少量炎癥細胞聚集為1級；局灶性炎癥細胞分布，滑膜輕度增生為2級；大量炎癥細胞浸潤，滑膜明顯增生，新生血管增加為3級；炎癥細胞浸潤明顯，滑膜增生明顯，血管翳形成，累及關節軟骨和周圍組織為4級。

1.5 大鼠腸系膜淋巴結淋巴細胞（mesenteric lymph node lymphocytes，MLNLs）分離 將大鼠腸系膜淋巴結放入盛有含5% FBS的D-Hank's液平皿的沙網（200目）中，去除脂肪及結締組織，然后經組織碾碎、離心分離，最終獲得重懸細胞。

1.6 MLNLs中 IL-2、IL-4、IL-17和 TGF-β 水平檢測 采用ELISA法。MLNLs懸液用10% FBS-DMEM培養液進行培養，調整細胞濃度為5×109個/L。在無菌的24孔培養板上，每孔加入500μl MLNLs懸液、500μl含ConA（終濃度為5 mg/L）的10% FBS-DMEM培養液，置于37℃、濕度飽和的5% CO2培養箱中培養48 h，2 000 r離心10 min，取上清液，使用ELISA試劑盒檢測IL-2、IL-4、IL-17水平。而TGF-β水平檢測選擇的是5% CO2培養箱中培養8 h的細胞、2 000 r離心5 min后棄上清液、使用D-Hank's液洗滌3次后加入無血清的DMEM培養液繼續培養72 h、2 000 r離心10 min獲得的上清液，使用ELISA試劑盒進行檢測。

1.7 MLNLs中輔助性T細胞17（T helper cell 17,Th17）、調節性T細胞（regulatory cell,Treg）細胞比例檢測 采用流式細胞術。取1 ml的MLNLs懸液，與1 ml的40% Percoll工作液混合均勻后轉至離心管中（含2 ml 70% Percoll工作液），4 ℃、1 200 r離心 20 min，收集淋巴細胞后調整細胞濃度為1×109個/L，用 FITC標記的抗大鼠CD4抗體、PE標記的抗大鼠CD25抗體標記Treg，用FITC標記的抗大鼠CD4抗體、PE標記的抗大鼠IL-17A抗體標記Th17，上流式細胞儀進行檢測。

1.8 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠關節滑膜組織病理學觀察 造模后，大鼠的滑膜組織細胞體積增大，排列紊亂，炎癥細胞浸潤，新生血管生成。蘄蛇CⅡ、塞來昔布對炎癥反應均有一定的抑制作用，給藥后炎癥細胞及微血管數量明顯減少，見圖 1（插頁）。

圖1 大鼠關節滑膜組織病理學觀察（a：正常組；b：模型組；c：對照組；d：高劑量組；e：中劑量組；f：低劑量組；H E染色，×100）

2.2 各組大鼠MLNLs中IL-2、IL-4、IL-17和TGF-β水平比較 各組大鼠MLNLs中IL-2、IL-4、IL-17和TGF-β水平比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與空白組比較，模型組MLNLs中IL-2、IL-4水平明顯降低，而TGF-β、IL-17水平明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，高劑量組、中劑量組及對照組MLNLs中IL-2、IL-4、TGF-β水平明顯升高，而IL-17水平明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組MLNLs中IL-2、IL-4、TGF-β水平明顯升高，而IL-17水平明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠MLNLs中IL-2、IL-4、IL-17和TGF-β水平比較（ng/L）

2.3 各組大鼠MLNLs中Th17、Treg細胞比例比較 各組大鼠MLNLs中Th17、Treg細胞比例比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與空白組比較，模型組MLNLs中Th17、Treg細胞比例均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組及對照組MLNLs中Th17細胞比例明顯降低，高劑量組及對照組Treg細胞比例明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組Th17細胞比例明顯降低，Treg細胞比例明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2和圖2（插頁）。

表2 各組大鼠MLNLs中Th17、Treg細胞比例比較（%）

圖2 各組大鼠M LNLs中Th17、Treg流式細胞術檢測結果（M LNLs為腸系膜淋巴結淋巴細胞，Th17為輔助性T細胞17，Treg為調節性T細胞）

3 討論

本團隊通過X線檢查觀察大鼠足趾腫脹程度及致炎關節，已證實蘄蛇CⅡ治療能緩解大鼠關節的腫脹程度，降低關節軟骨的損害，且相關作用具有一定的量效關系；蘄蛇CⅡ對大鼠T淋巴細胞具有免疫調節作用，可調節CIA大鼠外周血CD4＋水平和CD4＋/CD8＋，與劑量呈一定的相關性（待發表）。而本研究通過構建CIA大鼠模型進一步探討蘄蛇CⅡ治療CIA的相關作用機制，結果顯示蘄蛇CⅡ能明顯改善CIA大鼠病變關節的炎癥程度，可能是通過對大鼠MLNLs免疫調節機制產生影響而發揮作用的。其中減輕關節炎癥可能與蘄蛇CⅡ誘導體內產生口服耐受機制有關。口服耐受是指通過口服方式進食某種蛋白質后，再次攝入時機體發生全身免疫低反應狀態[3]。口服抗原的劑量是關系到口服耐受效果的重要影響因素，低劑量的抗原誘導自身反應性淋巴細胞主動免疫抑制，高劑量的抗原誘導克隆清除或克隆無能[4]。Th17、Treg作為2種新型Th細胞亞群，在關節炎自身免疫反應的發生、發展中起關鍵作用[5]。Treg特異性表達Forkhead家族蛋白3，具有抗炎作用，且在維持機體對自身組織免疫耐受方面發揮重要作用。研究表明，Treg可產生抑制性細胞因子，通過上調抑制性免疫細胞表面分子表達和下調活化T細胞的相關基因來抑制靶細胞誘導的免疫應答[6]。Th17 能分泌產生 IL-17、IL-21、IL-6、TNF-α 等細胞因子，其中IL-17是Th17最重要的效應因子，其受體在體內廣泛表達，可誘導其他炎癥細胞因子如IL-6、TNF-α等表達，引起炎癥細胞浸潤和組織損傷。可見，免疫內環境的穩定與上述2種細胞的比例平衡顯著相關。本研究結果顯示，蘄蛇CⅡ能使CIA大鼠MLNLs中IL-2、IL-4水平升高，且劑量越高效果越明顯，高劑量組與塞來昔布的效果類似，可能存在同樣的抗炎機制。此外，蘄蛇CⅡ和塞來昔布均能使CIA大鼠MLNLs中Treg細胞比例升高，Th17細胞比例降低，但相關比例較文獻報道的數據偏低[7]，可能受實驗方法和試劑的影響，亦可能是由于采集的細胞數量不足所致。

綜上所述，蘄蛇CⅡ治療能改善CIA大鼠關節滑膜組織的病理性改變，其作用機制可能是通過調節MLNLs中細胞因子水平和Th17、Treg細胞比例實現的。