白介素-17A通過自噬調控支氣管成纖維細胞膠原降解

姚培學 楊勝紅 陳杰 歐陽瑤

遵義醫科大學附屬醫院PCCM 呼吸一病區（貴州遵義563000）

慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）是常見的慢性呼吸系統疾病，其發病率和病死率高，嚴重影響人類的壽命和生活質量，給全球醫療衛生系統帶來巨大的壓力和挑戰［1-2］。氣道重塑是慢阻肺的特征性病理改變，支氣管成纖維細胞（bronchial fibroblasts，BF）是氣道重塑的主要效應細胞［3-4］。慢阻肺氣道重塑的具體發病機制尚未明確，目前已成為慢阻肺治療的難點［5-6］。白介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）是最重要的炎癥細胞因子，在氣道重塑中發揮重要的作用［7］。自噬是真核生物細胞中降解和回收利用細胞內受損、變性、衰老的長壽命蛋白及細胞器的過程。自噬在慢阻肺的研究中尚有爭議，不同的細胞類別自噬水平不同［8-9］。IL-17A 通過調控自噬參與多種慢性炎癥及纖維增生性疾病［7，10-12］。然而IL-17A 是否能夠通過抑制自噬影響支氣管成纖維細胞膠原代謝，從而參與慢阻肺氣道重塑的形成尚未明確。本研究從細胞水平驗證上述假設，闡明IL-17A 對支氣管成纖維細胞增殖、自噬及自噬后膠原降解的影響，為慢阻肺氣道重塑的靶向治療提供新的理論依據和手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物健康SPF 級SD 大鼠，雄性，重約150～180 g，用于原代支氣管成纖維細胞的分離、培養，購買于第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心［動物使用許可證號：00024737］，飼養于貴州省基礎藥理教育部重點實驗室。

1.1.2 實驗試劑膠原酶聯合消化液購自美國Sigma 公司；波形蛋白免疫熒光一抗、FITC 標記的羊抗小鼠二抗均購自BOSTER 公司；兔抗大鼠Beclin-1 、抗自噬微管相關蛋白1 輕鏈3（LC3）A/B單克隆抗體、p62 單克隆抗體均購自美國CST 公司；重組大鼠IL-17A 購自美國RD 公司；雷帕霉素購自MCE 公司；Anti-GAPDH antibody 購自Proteintech 公司；基質金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）與基質金屬蛋白酶抑制劑（matrix metalloproteinase inhibitor，TIMP-1）ELISA 試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BF 的分離與培養SD 大鼠頸椎脫臼處死后，以75%酒精浸泡消毒，取出完整的氣管與肺組織，浸泡在含有1%青鏈霉素的PBS 液中，剝離支氣管組織，并將其剪碎，應用酶聯合消化法+組織塊貼壁法，于37 ℃、5% CO2條件下培養，之后每3 天換液1 次，細胞長滿后傳代并鑒定。

1.2.2 CCK-8 法檢測不同濃度IL-17A 對BF 細胞增殖的影響取對數生長期大鼠BF，以8 × 103/孔的密度接種于96 孔板中（100 μL/孔），待細胞貼壁后分別予以不同濃度（0、5、10、20、40、80 ng/mL）IL-17A 干預。每組設5 個復孔，37 ℃孵箱中培養24 h；隨后加入10 μL CCK-8 試劑，繼續孵育1 h。使用酶標儀測定450 nm 處的吸光度，重復3 次檢測取平均值。

1.2.3 透射電鏡觀察大鼠BF 細胞的自噬情況對照組：不予以任何處理的BF；雷帕霉素組：2 μmol/L雷帕霉素處理的BF；雷帕霉素+IL-17A組：2 μmol/L雷帕霉素體外誘導BF 自噬后加入20 ng/mL IL-17A對自噬活化的細胞進行干預；IL-17A 組：20 ng/mL IL-17A 體外誘導的BF。各組分別培養24 h，收集細胞，PBS 液洗2 次后，3%戊二醛、1%鋨酸雙固定，包埋，聚合，超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙染色后透射電鏡下觀察各組BF 細胞內自噬泡情況。

1.2.4 Western blot 檢測自噬相關蛋白LC3、p62

蛋白的表達收集各組細胞提取蛋白，用BCA 法蛋白定量后電泳，用轉移系統將凝膠上的蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入LC3、p62、GAPDH 抗體4 ℃孵育過夜；洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后ECL 化學發光試劑盒顯色、曝光，保存圖片。使用Image J 軟件進行定量分析，實驗重復3～5 次。

1.2.5 ELISA 法檢測各組細胞上清液中MMP-1、TIMP-1的表達水平采用15 mL無菌離心管收集各組細胞上清液，4 ℃離心機離心25 min，2 500 r/min，收集上清液為ELISA 檢測樣品，按照酶聯免疫檢測試劑盒說明進行MMP1 及TIMP1 的測定。

1.3 統計學方法采用統計軟件SPSS 20.0 進行分析。計量數據以均數±標準差表示，組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代BF 細胞形態及鑒定酶聯合消化法+組織塊貼壁法分離培養原代BF 細胞1 d 后，在倒置相差顯微鏡下觀察可見單個BF 細胞已貼壁，培養3 d 后幾乎所有細胞變成梭形，偶可見多邊形細胞，培養至第5 天見細胞胞質伸展，單層融合，細胞形態呈長梭形、旋渦狀或放射狀（圖1）。經鑒定，BF 表面標記蛋白vimentin 呈陽性（圖2）。

圖1 酶聯合消化法+組織塊貼壁法分離培養原代BF（×100）Fig.1 Enzymatic digestion and tissue adherent method to isolate and culture primary BF（×100）

圖2 細胞免疫熒光鑒定BF 中vimentin 的表達（×100）Fig.2 Cellular immunofluorescence identification of vimentin expression in BF（×100）

2.2 不同濃度IL-17A誘導大鼠BF增殖的影響用CCK-8 法檢測（0、5、10、20、40、80 ng/mL）IL-17A誘導BF 的增殖情況，以確定最佳的IL-17A 濃度（圖3）。結果顯示，IL-17A 濃度為20 ng/mL 時BF增殖活力最強。

2.3 透射電鏡觀察IL-17A 對雷帕霉素誘導BF 的自噬情況透射電鏡觀察IL-17A 對雷帕霉素誘導BF自噬情況（圖4、5）。結果顯示，與對照組相比，在雷帕霉素誘導的BF 細胞中，自噬泡數量顯著增加（P＜0.05）；與雷帕霉素組相比，雷帕霉素+IL-17A組及IL-17A 組自噬泡數量顯著降低（P＜0.05）；與雷帕霉素+IL-17A 組相比，IL-17A 組BF 細胞的自噬水平進一步降低（P＜0.05）。

圖3 不同濃度IL-17A 誘導BF 增殖的影響Fig.3 Effects of different concentrations of IL-17A on the proliferation of BF

2.4 調控自噬后IL-17A 對雷帕霉素誘導BF 自噬的影響Western blot 檢測雷帕霉素促進BF 自噬后IL-17A 對BF 細胞自噬的影響（圖6）。與對照組相比，雷帕霉素組及IL-17A+雷帕霉素組中LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值上調，p62 的表達水平下調（P＜0.05）；與雷帕霉素組相比，IL-17A+雷帕霉素組及IL-17A 組中LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值下調，p62 的表達水平上調（P＜0.05）；與IL-17A+雷帕霉素組相比，IL-17A 組LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值進一步降低，p62 的表達水平進一步增強（P＜0.05）。

圖4 透射電鏡觀察IL-17A 對雷帕霉素誘導BF 的自噬情況Fig.4 Transmission electron microscope observation of IL-17A on rapamycin-induced autophagy in BF

圖5 各組BF 細胞內自噬泡數量統計Fig.5 Statistics of intracellular AV number of BF in each group

圖6 Western blot 檢測調控自噬后IL-17A 對雷帕霉素誘導BF 自噬的影響Fig.6 Western blot detection of the effect of IL-17A on rapamycin-induced autophagy in BF after regulating autophagy

2.5 ELISA 檢測各組BF 細胞上清液中MMP-1、TIMP-1 的表達量ELISA 檢 測IL-17A 對BF 細 胞上清液中MMP-1、TIMP-1 的表達量（圖7）。與對照組相比，雷帕霉素組中MMP-1 表達水平升高，TIMP-1 表達水平降低（P＜0.05），IL-17A 組MMP-1蛋白表達水平降低，TIMP-1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與雷帕霉素組相比，IL-17A +雷帕霉素組、IL-17A 組中MMP-1 表達水平降低，TIMP-1 表達水平升高（P＜0.05）。

圖7 ELISA 檢測各組BF 細胞上清液中MMP-1、TIMP-1 的表達量Fig.7 ELISA to detect the expression of MMP-1 and TIMP-1 in the supernatant of BF cells in each group

3 討論

氣道重塑是慢阻肺的病理基礎。氣道重塑是指氣道結構細胞功能改變、炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生導致黏液分泌增加、細胞外基質沉積導致氣道結構改變，引發不可逆性氣流受限［13］。氣道重塑與慢阻肺預后不良密切相關，直接影響患者病情轉歸。BF 在氣道重塑中發揮著重要作用［7］。因此，研究BF 的分子生物學機制對慢阻肺治療尤為重要。

IL-17A 作為一種促炎因子，能放大炎性反應和參與炎癥后纖維化過程［14-15］。臨床研究發現，慢阻肺患者支氣管肺泡灌洗液、痰液及肺組織中IL-17A 的表達顯著升高，且與肺功能的下降程度、血清C 反應蛋白水平和痰液中中性粒細胞數目呈正相關［16-18］。本課題組前期研究也發現，慢阻肺患者血清中IL-17A 水平升高，其對診斷慢阻肺和判斷慢阻肺預后有較高的敏感性和特異性［19］。另有研究證實IL-17A 可影響成纖維細胞細胞因子、膠原蛋白的合成，促進氣道炎癥及氣道重塑［20］，但IL-17A 是否會影響BF 增殖和膠原降解尚未見報道。本研究發現不同濃度IL-17A 處理BF 后，BF 的增殖活力均增強，其中最佳增殖濃度為20 ng/mL。提示IL-17A 誘導BF 增殖，導致BF 肥厚，同時能夠抑制膠原降解，促進細胞外基質的沉積。

自噬與IL-17A在慢阻肺氣道重塑中的關系密不可分，研究證實IL-17A可通過激活PI3K/AKT/mTOR及PI3K/AKT/Bcl2自噬相關通路，降低自噬水平［21］，另外，通過增強自噬，可以有效改善TGF-β細胞模型腎纖維化的程度，保護細胞模型損傷［22］。因此，本研究以BF 細胞自噬為主要切入點，觀察調控BF細胞自噬水平對其膠原降解的影響，同時觀察IL-17A 對BF 自噬的作用，為改善氣道重塑提供新的思路。本研究發現，IL-17A 能夠抑制BF 細胞自噬，表現為LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值減少，同時自噬經典底物蛋白p62 表達的減少。另外透射電鏡結果顯示IL-17A組細胞內自噬泡數量較正常對照組減少，進一步佐證了IL-17A能夠抑制BF細胞自噬。雷帕霉素部分逆轉了IL-17A的作用。此外，雷帕霉素誘導BF 自噬后，MMP-1 的表達水平升高，而TIMP-1的表達水平降低，加入IL-17A 刺激后MMP-1 的表達水平下調，TIMP-1 的分泌增多，提示IL-17A 與自噬和膠原降解的調控有一定聯系，自噬可促進BF細胞膠原降解。

綜上所述，本實驗通過體外培養原代BF 細胞，利用雷帕霉素誘導BF 自噬，觀察IL-17A 對BF自噬和其膠原降解的影響。本研究發現IL-17A對BF 具有促增殖作用，并且可以抑制BF 的自噬和膠原降解，提示氣道重塑的發生與BF 自噬和膠原降解密切相關。因此，本課題研究人員將繼續從體內外實驗深入研究IL-17A 抑制自噬的分子機制，為慢阻肺氣道重塑的防治和靶向治療提供更多可靠且有意義的理論支持。