間充質干細胞外泌體在眼部疾病中的研究進展①

付長秀 孫建偉 張蕓 吳文哲 鄭永欽 賀軍棟（昆明理工大學醫學院，昆明650000）

眼功能障礙是一種普遍存在的健康問題，世界衛生組織（WHO）在全球范圍內進行了數年的努力，已最大限度地減少視力損害或殘障。雖然治療策略已經發生了實質性的轉變，但仍存在一些挑戰。眼睛，一個獨特的視覺感覺器官，被認為是一個防止免疫原性炎癥的免疫豁免部位［1］。盡管如此，仍存在幾種涉及眼部的炎癥性疾病和免疫介導的疾病，嚴重的會導致視力障礙，例如干眼綜合征、角膜同種異體排斥反應、葡萄膜炎、年齡相關性黃斑變性等［2-4］。這些眼部疾病給人們的日常生活帶來了極大的不便，因此許多研究者都在探索新的治療方法。

1 間充質干細胞外泌體的發現及應用

間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是具有分化、釋放再生生長因子和免疫調節等功能且存在于多種組織中的成體干細胞［5］。MSC在一定條件下可以分化成各種類型的間充質譜系細胞，例如成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞［6］。它們具有增殖和遷移至損傷部位的能力，并通過分泌抗炎和生長因子促進傷口愈合［7］。它們還與先天和后天免疫細胞相互作用，并通過旁分泌作用調節免疫反應。目前普遍認為，MSC在體內以旁分泌方式起作用，而不是直接分化［8-9］。

根據細胞中囊泡分泌的方式，細胞外囊泡可分為兩大類：一類被稱為微囊泡，直接從細胞膜脫落；另一類稱為外泌體（exosomes），當多囊體與質膜融合時，通過胞吐作用釋放到細胞外環境［10］。外泌體最早是由PAN和JOHNSTONE在1983年發現的。他們發現在綿羊網狀紅細胞成熟過程中，轉鐵蛋白受體釋放到細胞外與一種小囊泡有關［11］。1989年，JOHNSTONE將這類功能性囊泡定義為外泌體［12］。外泌體是一種細胞外囊泡，直徑40~150 nm，包含特定的蛋白質、脂質、RNA和DNA［13］?？紤]到它們的納米尺寸，外泌體很容易穿過生物屏障并進入靶器官，可以與特定的受體細胞相互作用。研究發現，在外泌體表面上的磷脂酰絲氨酸受體、整聯蛋白、四跨膜蛋白、凝集素、聚糖以及其他黏附分子的表達有助于該過程［14］。外泌體可以通過巨胞飲作用、吞噬作用、受體介導的內吞作用或膜融合作用、內化作用將信息傳遞至靶細胞，或者不遞送內含物直接作用于細胞表面［15-18］。因此，外泌體已被認為是促進細胞間通訊和遞送蛋白質、RNA、DNA和其他分子成分，從而調節受體細胞功能的載體［19］。外泌體在生物體液中具有良好的耐受性，廣泛分布在尿液、血清、羊水、唾液、腦脊液、乳液和鼻分泌物中［20］。這些屬性為外泌體作為治療性遞送載體在心血管疾病、腎損傷、眼部疾病、類風濕性關節炎、肝纖維化等疾病中的應用提供了理論依據［21-24］。

盡管MSC移植具有明顯的優勢，但同種異體和異種免疫排斥，惡性轉化以及小血管倒伏和阻塞的風險仍然存在［25］。然而外泌體給藥可以避免所有這些潛在風險［26］。間充質干細胞外泌體（mesenchymal stem cell exosomes，MSC-Exos）具有與MSC相似的功能，并且與細胞相比，外泌體更安全、穩定、容易儲存。因此，作為基于間充質干細胞治療策略的安全且更有利的替代方法，間充質干細胞外泌體無細胞治療方法已經開發出來，并取得了一定的成果。例如，來自特定培養基中的MSC-Exos在體外具有一定程度的免疫抑制作用，并且通過抑制炎癥機制在葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠模型中表現出治療能力［13］。也有研究證明了載有miR-132的骨髓間充質干細胞（BMSC）外泌體作為微小RNA（mi-RNA）攜帶和轉移的載體，顯著增加了體外血管形成、Matrigel栓塞和心肌梗塞中的新生血管形成［27］。ZHAO等［28］也 發 現 來 源 于 骨 髓 的MSC-Exo通 過MAPK途徑促進成骨細胞的增殖，從而改善骨質疏松癥。本綜述重點討論外泌體在幾種眼病中的最新研究進展。

2 外泌體在眼部疾病中的相關研究

2.1 角膜相關疾病角膜相關疾病主要是化學或熱灼傷，創傷性損傷或免疫和遺傳性疾病引起的角膜創傷，與炎癥、新血管形成、潰瘍和瘢痕形成有關。不正確或延遲的治療可能導致失明。在過去的十年中，MSC療法作為抗炎、抗血管生成和免疫調節的治療策略得到廣泛的關注。在幾種組織模型中，MSC的旁分泌顯示出抑制炎癥和血管生成，促進組織傷口修復的作用。無細胞策略在促進角膜傷口修復中也發揮重要作用，其中涉及調節炎癥，血管生成和組織再生等各種因素。有研究已經證實了MSC-Exos中可溶性因子對角膜創傷模型的體內外治療作用。SHEN等［29］發現在兔脂肪MSCExos的共同培養下，兔角膜基質細胞增殖多，凋亡少，并有新的細胞外基質蛋白（包括膠原蛋白）沉積。在小鼠淺表間質創傷模型中，局部角膜基質干細胞來源的外泌體通過TSG-6依賴途徑，下調纖維化標志物肌腱蛋白-c、ACTA2、Col3A1和SPARC，抑制中性粒細胞浸潤，從而抑制角膜炎癥和角膜瘢痕［30］。SAMAEEKIA等［31］發現人角膜間充質干細胞外泌體可加速角膜上皮傷口愈合，可為眼表損傷提供治療方法。臍帶間充質干細胞和宿主細胞之間的囊泡可以傳遞活性的β-葡萄糖醛酸苷酶，使宿主細胞能夠分解代謝積累的糖胺聚糖，從而防止了角膜混濁和視力障礙的發展［32］。以上研究表明MSCExos在角膜的損傷中起到了修復治療的作用，并且為以后角膜相關疾病的治療提供了新的思路。

2.2 視網膜相關疾病視網膜疾病由許多因素導致，如氧化應激、遺傳疾病、光誘導損傷、化學損傷、血管缺陷或老化等。由于哺乳動物視網膜的自我再生能力有限，視網膜變性引起的視覺障礙很難治療。手術和藥物干預等治療方案更適合早期診斷的患者，對于晚期的患者并沒有明顯的效果。此外，一些視覺仿生設備，如ArgusⅡ，是一種無細胞視網膜植入物，作用于視網膜神經節細胞，以刺激色素性視網膜炎或年齡有關的黃斑變性患者的視覺傳輸，但是其費用十分昂貴，并且有用戶報告其在視覺輸出方面有一定的障礙［33-34］。因此，需要探索新的方法來治療視網膜疾病?，F有研究已經表明，MSC已經顯示出治療視網膜疾病的特殊前景，例如在急性視網膜損傷，視神經損傷和自身免疫性葡萄膜炎等疾病中都取得了良好的效果［35-37］。

MSC-Exos在視網膜疾病中的研究也越來越普遍。由于外泌體中含有許多微小RNA（mi-RNA）、長鏈非編碼RNA（Lnc-RNA）、蛋白質等物質，并且可以將這些物質靶向運輸到特定的細胞從而發揮修復損傷的作用。在激光誘發的視網膜損傷小鼠模型的玻璃體中，注射了源自小鼠脂肪組織和人臍帶的MSC及其外泌體后，均減輕了玻璃體損傷，抑制了細胞凋亡，并抑制了炎癥反應，且視覺功能的恢復程度相同。MSC-Exos注射到玻璃體后，視網膜中單核細胞趨化蛋白（MCP-1）明顯下調。在體外，MSC-Exos還下調熱損傷后視網膜細胞中的MCP-1 mRNA表達。而玻璃體內注射MCP-1的中和抗體促進了視網膜激光損傷的恢復，但同時使用MSC-Exos和MCP-1并沒有顯示出外泌體的治療作用。這些結果表明，MSC-Exos通過下調MCP-1來緩解激光誘發的視網膜損傷［38］。同樣，MSC-Exos還減輕了人視網膜色素上皮細胞藍光刺激和激光誘發的視網膜損傷，明顯下調了VEGF-A并逐漸改善激光誘導的脈絡膜新生血管的組織學結構，從而具有更好的視覺功能［39］。

高糖刺激和糖尿病都會引起視網膜炎癥等疾病?，F有數據表明，MSC-Exos可有效預防Ⅰ型糖尿病和實驗性自身免疫性葡萄膜炎的發病。此外，進行混合淋巴細胞反應測定表明MSC-Exos抑制了抗原呈遞細胞的激活，并抑制了Th1和Th17細胞的發育。由此也揭示了MSC-Exos替代細胞療法預防自身免疫性疾病的可能性［40］。高血糖大大增加了糖尿病大鼠或暴露于高葡萄糖的人視網膜內皮細胞（human retinal endothelial cells，HREC）的炎癥，增加了caspase-1、IL-1β和IL-18的水平。MSC-Exos可以有效地逆轉這種反應。與對照MSC-Exos相比，過表達miR-126的MSC-Exos顯著降低了高葡萄糖誘導的HREC中HMGB1表達和NLRP3炎性體的活性，更成功地抑制了HMGB1信號傳導途徑并抑制了糖尿病大鼠的炎癥。實驗結果表明MSC-Exos中的miR-126表達通過下調HMGB1信號傳導途徑來減少高血糖誘導的視網膜炎癥［41］。

黃斑裂孔對于50歲以上的女性來說是一種健康威脅，會使中心視力下降，并且其發病機制目前尚不清楚。ZHANG等［42］的研究表明MSC-Exos治療可促進黃斑裂孔功能的恢復。由此說明，對于難治性黃斑裂孔患者，MSC-Exos治療可能是一種有效和安全的改善術后視力的方法。

綜上所述，MSC-Exos在視網膜疾病中起到了一定的保護及修復作用，還在治療炎癥方面扮演著重要角色。但是，其抗炎和免疫調節等作用有關的具體機制值得進一步研究。

2.3 眼部神經相關疾病視網膜神經節細胞（retinal ganglial cells，RGC），既不可替換，又不能軸突再生。RGC的功能障礙和喪失（例如青光眼和外傷性視神經病變）是失明的主要原因。之前已證明BMSC作為神經保護藥是有效的?，F在有研究證明BMSC衍生的外泌體為RGC的保護提供了顯著的治療益處，這是由其miRNA而不是蛋白質介導的。并且外泌體不存在將活細胞移植到玻璃體中相關的并發癥風險（免疫排斥，有害的增殖/分化）［43-44］。在嚙齒動物青光眼模型中，外泌體可以主動整合到神經元從而促進神經保護。外泌體在神經系統的研究雖然剛剛開始，但是已經取得了初步的成果，為以后研究眼部神經相關疾病提供了新的策略。

3 小結及展望

MSC-Exos已經在眼部疾病中顯示出巨大的應用潛力，首先，MSC-Exos能夠抑制角膜炎癥，促進角膜傷口愈合等作用；其次，無論在激光刺激的視網膜損傷還是高糖誘導的視網膜損傷中，MSC-Exos都可以緩解其損傷或炎癥程度，對于難治性黃斑裂孔的術后恢復也有很大的幫助；最后，MSC-Exos還可以在青光眼中促進神經保護。雖然MSC-Exos在眼部疾病中已經取得一定的成果，但是仍然存在著許多未知和挑戰。首先，由于外泌體是高度異質的，不同來源的外泌體對眼部疾病的作用是不一樣的，因此預選外泌體的最有效組織來源至關重要；其次，MSC-Exos在眼部疾病中的分子作用目前尚未闡明，還需要進一步研究。此外，MSC-Exos的注射頻率和劑量仍然沒有確定，不能保證MSC-Exos持久的作用。為了成功地轉化為臨床療法，迫切需要新穎和先進的技術來獲得大量具有穩定功能的高純度外泌體。有挑戰就有希望，外泌體有望成為治療眼部疾病的新策略，從而為眼部疾病患者帶來新的希望。