Ca2+與類風濕關節炎的相關性研究?

楊 越，李 露，崔瑋璐，曹 煒

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)主要臨床表現為侵蝕性、對稱性多關節炎且主要累及小關節，是一種慢性、全身性自身免疫性疾病。其基本病理特點為滑膜炎和血管翳形成，隨著病情的發展會逐漸出現關節軟骨以及骨的破壞，在此基礎上最終可能導致關節的畸形和功能的喪失[1]。在我國，RA的患病率在0.2%～0.4%左右[2]。RA病因復雜，主要與遺傳、激素、環境、免疫紊亂等有關[3]，但其發病機制尚未徹底研究清楚。中醫主要認為其與內正氣虛、外邪氣盛有關，屬于“歷節”“痹病”等范疇。臨床上西醫針對RA的治療仍以藥物治療為主，包括非甾體類抗炎藥、糖皮質激素、改善病情的抗風濕藥、植物藥制劑以及生物制劑等，其不良反應尚多；中醫辨證論治針對不同類型的患者采取個體化中醫藥治療方案，不良反應少。鈣離子(Ca2+)是一種重要的信號分子，在機體內調控著廣泛的生物功能。Ca2+幾乎影響到細胞生命的各個方面，參與凝血、肌肉收縮、神經遞質及激素的合成等各種基本細胞功能。有研究[4]發現，Ca2+在RA的發生發展中起著關鍵作用，而很多中藥可以調控Ca2+，基于對此的探索，可能會為RA的診斷、治療以及發病機制帶來更開闊的思路。

1 RA中Ca2+在骨代謝中的標志作用

RA患者在病理上除表現為滑膜炎、血管翳之外，還有一個重要的病理特點即骨質破壞，這也是RA患者后期致殘的根本原因。不采取任何治療措施的RA患者2年致殘率達50%，3年致殘率可達70%，將近50%的RA患者因為致殘而最終喪失勞動力[5]。骨質破壞致使骨代謝失衡，如骨再吸收增加致鈣離子釋放入血形成的高血鈣，以及骨生成標志物骨鈣素水平的下降。

1.1 骨再吸收增加與高血鈣

骨再吸收的本質為破骨細胞分解吸收骨的過程，它是RA中骨丟失導致骨質破壞的一個關鍵環節。有文獻[6]報道，白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、核因子-κB(nuclear factor -κB,NF-κB)受體激活劑(nuclear factor-κB receptor activator,RANKL)和甲狀旁腺相關肽(parathyroid peptide,PTH rP)等細胞因子及激素可以刺激骨再吸收，而IL -6 、RANKL以及PTH rP的表達被證明與RA患者活化的滑膜成纖維細胞血管翳侵入相關。與惡性疾病類比，RA中的血管翳就如惡性腫瘤一樣侵入相鄰的骨及軟骨，并與惡性疾病患者的骨質溶解相似，RA患者的骨再吸收增加也會伴隨著血鈣的升高。劉富強[6]等以146例RA患者研究血清鈣離子與疾病之間的關系時發現，有30.1%的受試者血鈣過高，且血鈣高的RA患者疾病活動度較血鈣正常患者高。

血清中鈣離子水平由骨再吸收、腸道吸收、腎臟重吸收及經腎臟排泄共同決定。在劉富強等研究中發現：(1)1,25-二羥基維生素D3(1,25D3)水平與C反應蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)和IL -6 呈負相關，即患者血清中1,25D3 的水平與疾病活動負相關，而鈣經腸道吸收主要受1,25D3 水平和作用的影響，因此疾病活動度高的RA患者血清中低水平的1,25D3提示腸道鈣吸收相對減少；(2)RA患者血清免疫活性甲狀旁腺素水平與疾病活動指標(ESR 、IL -6)、血清鈣離子呈現負相關性，且血清鈣離子水平與晨尿中鈣/肌酸酐的比率呈正相關性，而腎臟重吸收鈣需要甲狀旁腺素的參與，這表明高疾病活動度對應低水平甲狀旁腺素，從而導致腎臟重吸收減少；(3)尿中吡啶醚(pyridinoline,PYD)/肌酸酐和脫氧吡啶醚(deoxypyridinoline,DPD)/肌酸酐與ESR、CRP及IL -6呈顯著正相關，PYD和DPD是骨代謝特異的生化指標[7]。由此可以看出，RA患者的高血鈣與腸道吸收、腎臟重吸收及排泄相關性低，而與骨再吸收增加相關性高，并且高血鈣的水平可能預示著與疾病活動相匹配的骨量流失。

1.2 骨生成標志物骨鈣素

骨鈣素作為骨生成的標志物，骨鈣素水平下降代表骨生成減少，不能發生正常的骨化，這也是RA患者發生繼發性骨質疏松以及關節畸形的原因。骨鈣素是一種鈣結合蛋白，由成骨細胞分泌，其分泌的骨鈣素可以被重吸收成為骨基質的組成部分，還有一部分會分泌至外周血液循環。因此檢測血液中骨鈣素水平，可以顯示骨生成的動態變化[8]。曹賢[9]等在實驗中發現，按關節功能分級的實驗組患者骨鈣素水平低于健康對照組，差異有統計學意義，并且隨患者關節功能分級的增加，骨鈣素水平逐步下降，這表明新骨生成在逐步減少。在葛金蓮[10]等實驗研究中發現，經糖皮質激素治療的RA患者發生骨質破壞時，最開始出現的是血清骨鈣素水平降低。然而在王鑫[11]與Terpos[12]的研究中，RA患者血清骨鈣素水平高于健康對照組，對此可能的解釋為在骨吸收增加的同時，機體會產生代償性骨形成，這或許與關節畸形有很大關聯。出現這樣的實驗結果可能與實驗條件的控制有關，如病例的選擇、檢驗誤差等，但其病理本質仍然為關節骨質的破壞，因此臨床醫生要根據不同時期骨鈣素的實際水平做出謹慎判斷。

2 RA中的鈣結合蛋白

雖然RA具體的發病機制尚未完全研究清楚，但目前的一些研究發現，鈣結合蛋白在RA的發病機制中有著不可小覷的媒介地位。

2.1 鈣衛蛋白

鈣衛蛋白(calprotectin,CLP)是S100A8/S100A9異二聚體，屬于S100蛋白家族，來源于中性粒細胞和巨噬細胞。先前的研究顯示，CLP在炎癥反應中發揮重要作用，其可激活被晚期糖基化終末產物受體(the receptor for advanced glycation end products,RAGE)或Toll樣受體(TLR)感知的先天免疫通路。CLP與TLR4結合后能產生廣泛的中性粒細胞效應，從而生成細胞因子、基質金屬蛋白酶、趨化因子以及活性氧。CLP的水平隨著中性粒細胞的激活而增加，并能增強中性粒細胞的氧化，還可直接誘導微血管內皮細胞產生明顯的炎癥和凝血反應[13]。最近有文獻[14]報道，RA患者的血液和滑膜液中CLP水平升高，在動物關節炎模型中，CLP的缺失幾乎完全阻止軟骨的破壞，CLP可促進巨噬細胞和內皮細胞產生細胞因子，調節軟骨細胞凋亡，并發現CLP水平與RA患者的臨床癥狀、實驗室參數、疾病活動、超聲和放射學進展以及治療反應密切相關。此外，鈣衛蛋白還可以使T細胞的極化傾向于Th17極化。體外研究表明，S100A8通過RA滑膜細胞刺激IL-6表達，進而促進Th17的分化[15]。還有研究發現，當抗風濕藥物逐漸減少時，RA患者的鈣衛蛋白水平會升高，不過由于數據不足，還需要更多的實驗研究來證實鈣衛蛋白是否可以作為RA患者逐漸減少或停用抗風濕藥物的生物標志物[16]。以上研究表明，CLP可能作為一種生物標志物參與RA的病理過程，對于鈣衛蛋白的深入研究將為RA的發病機制帶來新的發現。

2.2 鈣網織蛋白

鈣網織蛋白(calreticulin,CRT)也是一類鈣結合蛋白。最開始的研究顯示，CRT作為內質網鈣結合蛋白，其含量水平與內質網鈣存儲能力成正相關，因而在調節機體鈣平衡中有著重要的地位[17]。更多的研究發現，鈣網織蛋白是一種多功能蛋白，在體內具有多種生物功能，并發現其可能參與RA的形成與發展。在天津醫科大學鄭芳教授課題組的研究中發現，與健康對照組比較，RA患者的血清CRT含量高于對照組，其含量水平與疾病活動度顯著相關，且CRT在RA滑膜組織中也呈現高表達狀態。進一步的機制研究探索到，CRT可與TRAIL(凋亡分子)結合進而抑制TRAIL誘導的JurkatT細胞凋亡，從而引發RA炎癥[18]。高表達的CRT還可通過激活PI3K/Akt和STAT3信號通路，使RA滑膜成纖維細胞中抗凋亡分子Bcl-XL和Mcl-1表達上調，通過PI3K/Akt-eNOS-NO信號通路，促進新生血管的形成[19]；通過上調抗凋亡基因c-FLIP，使RA滑膜成纖維細胞產生凋亡抵抗，進而發生滑膜增厚和血管翳。研究還發現，c-FLIP的表達激活了NF-κB信號通路，引發血管新生、釋放炎癥因子等病理過程，導致持久的關節滑膜炎癥浸潤[20]。課題組還發現，在RA患者的血清和關節液中，CRT與黏附分子sICAM-1和sVCAM-1的含量均呈現正相關關系。且實驗結果提示，CRT可能是通過PI3K/Akt/eN0S信號通路調節黏附分子的表達，繼而引發RA滑膜炎癥[21]。國外有研究發現，細胞表面CRT作為RA共享表位(HLADRB1等位基因編碼的5個氨基酸序列基序)的信號傳導受體，參與共享表位傳導Th17極化信號，從而在RA中發揮致病作用[22]。以上研究表明，鈣網織蛋白對RA的發生發展有著多方面的影響，可能是RA發病機制中的一個重要環節。

3 Ca2+穩態

Ca2+是鈣信號系統的信使，細胞內質網鈣庫中的鈣釋放能夠觸發鈣信號，進而傳導體內的生物信息，以完成機體的各種功能需要。內質網中的Ca2+處于穩態平衡才能確保鈣信號的準確傳導，一旦Ca2+水平失衡就會導致細胞生理功能失常，從而引發各種疾病。先前有報道發現，Ca2+作為第二信使在基因轉錄、細胞運動、增殖、凋亡以及免疫反應中有信號傳導作用[23]。更有研究顯示，胞內Ca2+信號與自身免疫性疾病的發病機制有關，如RA[24]。

近年來，Ca2+信號與RA的相關研究逐步增多。Yoon[25]等發現，中藥雷公藤的生物活性成分雷公藤紅素能夠促進Ca2+動員介導的內質網應激，而Ivo R[26]等在RA患者的滑膜成纖維細胞中發現，雷公藤紅素治療后內質網應激產生的Ca2+動態變化，可以調節炎癥基因表達譜，雷公藤紅素顯著下調了一些與RA滑膜成纖維細胞病理生理控制相關的基因表達。并經驗證后發現，這些基因產物所介導的分子通路，可能在RA滑膜成纖維細胞中形成一個復雜的網絡并相互串擾，其中涉及到Ca2+參與的鈣蛋白酶/鈣調蛋白-鈣調神經磷酸酶-NFATc3信號軸。該信號軸本身是一個Ca2+相關通路，在RA發病過程中不可避免地調節軟骨分解代謝、破骨細胞形成、血管生成和炎癥[27]。當Ca2+內流時，鈣傳感器蛋白鈣蛋白酶和鈣調蛋白與陽離子結合并激活鈣調神經磷酸酶，進一步去磷酸化NFATc3[28]，激活下游的炎癥通路。Vincent Kam[29]等在進一步的研究中也發現，雷公藤紅素確實可以通過激活Ca2+信號通路，下調RA滑膜成纖維細胞的炎癥反應基因，從而緩解RA患者的癥狀。研究還發現，雷公藤紅素可通過觸發Ca2+信號誘導RA滑膜成纖維細胞的自噬性細胞死亡，且鈣信號傳導阻滯后會減弱雷公藤紅素的體內外作用。Yune-Jung[4]等還發現，在免疫應答的過程中，T細胞和B細胞抗原受體結合后會誘導細胞內Ca2+存儲下降，然后激活鈣庫操縱性鈣內流，從而提高細胞內Ca2+的濃度。由此可見，調節胞漿內Ca2+的分布可能是未來治療RA的一種策略，相關研究為此方面藥物的研發提供了科研思路，有助于開發新的治療方式或改進傳統治療方法。

4 中藥對Ca2+的影響

有研究發現，中藥可調節Ca2+進而緩解病情，這進一步表明Ca2+與RA發病密切相關，同時也說明中醫藥治療RA不僅有良好的臨床療效，也有令人信服的科學研究依據。楊慶萬等[30]在臨床實驗中，將長期接受激素療法的RA患者分為治療組口服甲潑尼龍片、甲氨蝶呤片、碳酸鈣D3片并服用中藥引火湯；對照組口服甲潑尼龍片、甲氨蝶呤片、碳酸鈣D3片，相比之下治療組在降低甲狀旁腺激素，改善25-羥基維生素D3、L2-4骨密度平均值水平方面較對照組強，并發現引火湯可以平衡長期口服抗風濕藥物RA患者的骨代謝及鈣磷代謝。陳慧等[31]通過網絡藥理學發現，四妙丸可經鈣調蛋白1-單加氧酶活性的正調節等生物過程對RA發揮療效。甘小明[32]在補腎化瘀法對早期RA骨代謝影響的實驗中，對照組口服阿法骨化醇軟膠囊加鈣爾奇D片，實驗組采取補腎化瘀法加減治療，治療后顯示2組在血鈣、骨密度方面差異有統計學意義，中藥補腎化瘀法療效顯著，并可促進RA患者骨礦物質的沉積。RA后期出現的骨質疏松，中藥對其也有良好的改善作用。龐學豐等[33]運用補腎抗風濕中藥寒痹康湯聯合西藥治療RA繼發骨質疏松患者，治療后患者的臨床癥狀及骨代謝狀況明顯改善。李杰[34]運用右歸丸加減湯劑治療骨質疏松癥后發現，患者骨吸收指標(血清I 型膠原羥基端肽降解產物)顯著下降，骨形成指標(1型原膠原N-端前肽)也降低，而骨密度較治療前增高。

以上中藥對 Ca2+的影響，包括提到的中藥成分雷公藤紅素能夠促進Ca2+動員介導的內質網應激，最終都能達到治療RA的目的，說明Ca2+對RA的發生發展至關重要。但是目前尚缺直接的實驗證據，鈣結合蛋白等標志物與Ca2+水平及分布關系等方面的實驗研究有待進一步發展。

5 小結

骨代謝中骨再吸收增加會導致血鈣水平增高，此時高水平的血鈣是因為骨中鈣離子釋放入血，所以盡管RA患者血鈣濃度高，患者仍然需要進行補鈣，防止因骨鈣缺失而出現骨質疏松的情況。另一方面，機體的血鈣自穩系統雖然會及時糾正機體的血鈣水平，但當機體長時間處于大量缺鈣狀態時，血鈣自穩系統無法發揮它的作用，而此時甲狀旁腺在缺鈣的刺激下大量地分泌甲狀旁腺素，進而引起骨鈣降低、血鈣以及軟組織鈣含量的增加。由此可以看出，缺鈣時機體血鈣濃度未必只出現降低這一種情況。因此活動期RA患者即使發現血鈣升高，也要警惕可能發生的骨質破壞，在RA病程中時刻注意鈣含量的補充。骨鈣素水平的降低代表骨質破壞，它與高血鈣都對RA的預判和治療有著指導意義。

鈣衛蛋白、鈣網織蛋白以及Ca2+穩態是類風濕關節炎發病機制中的重要環節，它們在血液、滑膜液以及胞漿中的分布影響RA病情的進展，但這些由Ca2+參與的重要標志物與血鈣變化水平的相關性研究尚缺，對此的研究可能有助于RA發病機制的深入探討。另外，相關中藥影響Ca2+的研究不僅為RA的中醫藥治療提供科學依據，也為進一步揭示RA發病機制及治療RA探索了新的路徑。

以上這些為藥學專家以及科研人員提供了治療RA的新思路，可以從中探尋新的藥物靶點，從而為治療RA帶來新的治療策略。如從Ca2+角度進行RA發病機制的相關研究，進一步揭示RA病因病機，探尋與雷公藤紅素相類似可以影響Ca2+分布的藥物成分及能夠平衡體內鈣濃度的中藥及其藥物成分等。