中藥調控胞葬作用物質基礎及用藥規律的研究?

王建茹，李 彬，王新陸，彭廣操，趙齊飛，于 瑞，王永霞，朱明軍

(河南中醫藥大學第一附屬醫院，鄭州 450000)

胞葬作用(Efferocytosis)是指胞葬細胞將死亡細胞及時清除的過程[1，2]。人體內每天都有數十億細胞發生死亡，死亡細胞與胞葬細胞通過不同信號傳導，促進其被及時有效的清除，介導各種不同的病理生理結果[3]。胞葬作用介導多種系統疾病的病理過程，在維持組織穩態、組織修復等方面發揮著重要作用，已成為近幾年治療疾病的潛在性干預靶點和新的研究方向[3，4]。

中藥及其復方具有多成分、多靶點、多途徑和多效應的特點，在治療疾病方面表現出明顯的優勢[5]。研究報道，具有益氣活血祛痰功效的中藥復方冠心康可改善動脈粥樣硬化病理過程中受損的巨噬細胞胞葬作用，其機制可能與其上調胞葬作用相關信號分子的表達有關。這提示中藥通過干預胞葬作用治療疾病具有廣闊的應用前景[6]，但目前這方面的相關研究較少。網絡藥理學具有整體性和系統性等特點，分子對接技術是預測受體分子與配體化合物結合模式和親合力的方法，兩者聯合已被廣泛用于闡釋中藥治療疾病的物質基礎和潛在作用機制的研究中[7-9]。

本研究以胞葬作用這一熱門表型為切入點，利用網絡藥理學和分子對接方法，系統預測胞葬作用相關靶點、活性成分和中藥三者之間的復雜對應關系，同時挖掘中藥性味歸經的分布情況，初步探討中藥調控胞葬作用的藥效物質基礎及一般用藥規律，以期為后續治療胞葬作用功能障礙相關疾病、藥物的研發以及中醫藥現代化等方面的研究提供一定的科學依據。

1 對象與方法

首先從GeneCards數據庫中獲取胞葬作用相關靶點。其次在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數據庫中，以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥18%為條件，篩選出作用于胞葬作用相關靶點的活性成分，并在TCMSP數據庫中匹配出包含這些活性成分的中藥，然后再利用Autodock Vina軟件進行分子對接，以驗證中藥活性成分與胞葬作用相關靶點之間映射結果的科學性和可信性；同時，利用Cytoscape軟件構建活性成分-靶點網絡、表型-靶點-成分-中藥網絡進行可視化，并采用軟件中的Network Analyzer工具進行網絡拓撲分析，篩選關鍵網絡節點。最后在中醫藥整合藥理學研究平臺V2.0、化學專業數據庫、中國醫藥信息查詢平臺中收集已匹配出的中藥性味歸經信息，統計分析其出現的頻次和頻率，并對中藥用藥規律進行分析，具體步驟見圖1。

圖1 研究思路圖

1.1 收集胞葬作用相關作用靶點

為獲取與胞葬作用相關的作用靶點，在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中以“efferocytosis”為檢索詞進行檢索。由于不同數據庫基因代號不統一，需通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)對所有作用靶點名稱進行標準化。

1.2 篩選中藥的活性成分

TCMSP是一種獨特的從系統水平研究中藥作用機理的平臺，包含499味草藥以及每味草藥的化合物成分(共計29000余個)，針對每個化合物提供了較全面的人體吸收、分布、代謝等藥代動力學數據，同時也提供了潛在活性分子靶標及其疾病信息，形成了針對每位草藥的藥物-靶標-疾病網絡。將1.1獲得的胞葬作用相關靶點輸入到TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中，以OB≥30%、DL≥18%為條件，篩選中藥的活性成分。

1.3 構建中藥活性成分-靶點網絡圖

將1.1獲得的胞葬作用相關靶點和1.2獲得的中藥活性成分導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建活性成分-靶點網絡圖，將兩者的映射關系進行可視化，然后利用Network Analyzer工具分析網絡拓撲參數，識別關鍵網絡節點。

1.4 活性成分-胞葬作用相關靶點分子對接

為驗證預測的胞葬作用潛在作用靶點與中藥活性成分之間相互作用關系的可信度，將胞葬作用潛在作用靶點與其所對應的活性成分進行分子對接。首先，從蛋白質數據庫(protein data bank,PDB，http://www.rcsb.org/pdb/)中檢索人源胞葬作用相關靶點的PDB ID號，用PyMOL軟件去除水分子和配體等，Auto dock Tools軟件加氫然后轉換成pdbqt格式。其次，從PubChem數據庫 (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載中藥活性成分的分子結構，保存為SDF格式，再用ChemBio3D進行優化，保存為mol2格式。最后，利用Autodock Vina軟件進行分子對接，獲取結合能值，對接結果采用Discovery Studio Visualizer 4.5和PyMOL軟件進行可視化。結合能數值為負則提示活性成分與作用靶點可自由結合，數值越小說明對接體系越穩定，對接結果越可靠。本研究設定自由結合能小于-5 kcal/mol代表結合具有顯著性，說明活性成分與靶點之間作用關系可信度高。

1.5 構建“表型-靶點-成分-中藥網絡圖”

在excel表中分別構建“中藥-活性成分”“活性成分-靶點”“靶點-表型”文件，并將這些文件輸入到Cytoscape3.7.2軟件中，利用Network Analyzer工具進行網絡拓撲參數分析，篩選出關鍵節點，并構建“表型-靶點-成分-中藥網絡圖”進行可視化。最后，依據網絡中各節點拓撲學參數信息，初步評價中藥及其活性成分調控胞葬作用的功效強度。

1.6 中藥獲取及其數據整理分析

為獲取具有調控胞葬作用的中藥，將1.2中獲取的具有調控胞葬作用的中藥活性成分輸入到TCMSP數據庫中收集匹配的中藥。為分析具有調控胞葬作用中藥的用藥規律，將匹配出的中藥再輸入到中醫藥整合藥理學研究平臺V2.0(http:∥www.tcmip.cn/)、化學專業數據庫(http:∥www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)、中國醫藥信息查詢平臺(https:∥www.dayi.org.cn/)中收集這些中藥的性味歸經信息，并統計分析各個中藥性味歸經出現的頻次和頻率。若中藥的性味歸經不止1個，則要全部如實記錄。出現頻率=出現頻次/總頻次×100%。

2 結果

2.1 胞葬作用相關靶點的篩選

從Gene Cards數據庫中共檢索到與胞葬作用相關的靶點73個，其中41個靶點在TCMSP數據庫中沒有收錄，8個靶點雖有收錄但無匹配的化合物，24個靶點檢索到匹配的化合物。以OB≥30%、DL≥18%為條件，對24個靶點匹配的化合物進行篩選，結果10個靶點的化合物不符合標準，其余14個靶點匹配的化合物符合，這14個靶點即為胞葬作用的潛在靶點，在胞葬作用的過程中充當不同角色，并發揮著不同的功能(見表1)。

表1 胞葬作用的潛在靶點信息

2.2 中藥活性成分的獲取

在TCMSP數據庫中，以OB≥30%、DL≥18%，并能匹配胞葬作用的潛在靶點為條件對中藥的活性成分進行篩選，結果共獲得24個活性成分(見表2)。將24個活性成分在TCMSP數據庫中分別匹配中藥，匯總剔除重復中藥后共獲得368種藥物。368味中藥所包含活性成分的數量在1～12個之間，其中含有1個活性成分的中藥最多達102味，其次是含有6個活性成分的中藥共72味；另外，含有12個活性成分的中藥有2味分別為半枝蓮和木蝴蝶，有1味中藥(白果)含有11個活性成分(見圖2)。

圖2 預測中藥所包含活性成分分布情況比較

表2 中藥活性成分信息比較

2.3 活性成分-靶點網絡圖的構建

活性成分-靶點網絡圖由38個節點、78條邊組成，度值范圍為1～12，平均度值為2.053；網絡中節點代表活性成分或靶點，邊表示節點間的作用或對應關系，度值表示與該節點直接相互作用節點的數目，度值越大說明該節點的樞紐性越強，在整個網絡中的調控作用越大，生物學功能的重要性越強。

圖3中的藍色圓形節點代表中藥活性成分，紅色六邊形節點代表胞葬作用潛在靶點；其中度值排名前8位的活性成分分別關聯2個以上的靶點；度值排名前7位的靶點分別映射2個以上的中藥活性成分。結果提示，這些活性成分和靶點較重要，可對其進一步開展深入研究。

圖3 活性成分-靶點網絡圖

2.4 分子對接結果

結果表明，提取出的39對“活性成分-作用靶點”關系對中，胞葬作用潛在靶點與中藥相關活性成分均存在不同程度的結合，結合自由能均小于-5 kcal/mol，說明預測結果具有一定的科學性和可靠性(見表3)。結合自由能≤ -9.5 kcal/mol的3對關系對的分子對接結果示意圖，顯示活性成分與胞葬作用潛在靶點之間具有良好的親和力，兩者大多以氫鍵的形式相互作用(圖4)。

表3 活性成分與胞葬作用相關靶點分子對接信息比較

注：A.Baicalein-ALOX12；B.Triptolide-CD274；C.Quercetin-NFE2L2;A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、C-2為對接空間位置的3D立體圖；A-3、B-3、C-3為對接作用的2D平面圖圖4 活性成分與靶蛋白分子對接結果示意圖(結合自由能 ≤ -9.5 kcal/mol)

2.5 “表型-靶點-成分-中藥網絡圖”的構建

根據預測的中藥與其所含有的活性成分以及胞葬作用潛在靶點的對應關系，初步構建“表型-靶點-成分-中藥網絡圖”，該網絡中共含407個節點，1594條邊，度值范圍為1～7，平均度值為3.916。度值排名前3的中藥共12味占比3.26%，這些藥物除黃芩、雞血藤外，其余10味中藥所關聯的胞葬作用潛在靶點均在9個以上(見圖5、6)，結果表明半枝蓮、木蝴蝶、苦參、白果、葛花、紅花、黃柏、麻黃、牛膝、山豆根這10味中藥在干預胞葬作用方面具有較大的潛在調控作用。本研究選取度值≥4的中藥及其所關聯的活性成分、胞葬作用潛在靶點重新構建網絡圖，以便直觀地展示胞葬作用潛在靶點、活性成分、中藥之間的對應關系(如圖7)，紅色菱形節點代表胞葬作用這一表型，紫色V節點代表與胞葬作用相關的潛在靶點，綠色三角形節點代表預測的能調控胞葬作用的活性成分，黃色圓形節點代表預測的具有調控胞葬作用的中藥。

圖5 預測中藥度值的分布情況

圖6 預測中藥對應胞葬作用相關靶點的分布情況

圖7 表型-靶點-成分-中藥網絡圖

2.6 中藥性味歸經的分布情況

368味中藥性微溫者有3味，微寒者12味，均按性溫、性寒記錄；藥味微酸者2味，微甘者1味，微辛者3味，微苦者10味，均按味甘、味辛、味苦記錄；有9味藥物未收集到歸經信息。對中藥的性味歸經頻次進行統計，發現藥味總頻次為587次，藥性總頻次為368次，歸經總頻次為835次。具有調控胞葬作用的中藥在藥味方面以味苦的出現頻次和頻率最高，其次為味辛和味甘；在藥性方面，以性寒的出現頻次和頻率最高，其次為性溫和性平；在歸經方面，以肝經的出現頻次和頻率最高，其次為肺經、胃經(見表4圖8)。

圖8 中藥的歸經分布

表4 中藥的性味分布

3 討論

胞葬作用由專職的和非專職的吞噬細胞(即胞葬細胞)完成，其中主要的細胞類型為巨噬細胞，胞葬細胞與死亡細胞通過它們表面的食我信號和尋我信號，以“配體-受體”的直接結合形式和“配體-調理素-受體”的間接結合形式，完成對死亡細胞的識別、捕獲、降解過程，從而抑制促炎因子和毒性分子的釋放，促進抗炎因子的釋放；同時，非食我信號分子可負性調控以上2種結合形式[10]。此外，胞葬過程還受一些非胞葬作用相關信號分子的調控[11]。本研究預測的14個胞葬作用潛在靶點中，大多為非胞葬作用相關信號分子和食我信號分子，這些靶點中白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(interleukin 1 beta，IL1B)、尿激酶型纖溶酶原激活物受體(plasminogen activator urokinase receptor，PLAUR)、轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、白細胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)、核轉錄NR-E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NFE2L2)、白細胞分化抗原274(cluster of differentiation 274，CD274)的功能作用較重要，值得進一步深入研究。由于檢索數據庫的不完善，一些已經被證實的介導胞葬過程的信號分子未被篩選出來，如Mer受體酪氨酸激酶(mer tyrosine kinase，MerTK)、T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域含4(t cell immunoglobulin and mucin domain containing 4,TIMD4)、乳脂球-表皮生長因子8蛋白(milk fat globule-EGF factor 8 protein,MFGE8)、白細胞分化抗原47(cluster of differentiation 47，CD47)等。

活性成分-靶點網絡顯示，具有調控胞葬作用潛在靶點的24個中藥活性成分大多屬于黃酮類化合物、生物堿和萜類化合物，其中槲皮素(quercetin)、雷公藤甲素(triptolide)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate]、漢黃芩素(wogonin)、非瑟酮(fisetin)、芍藥苷(paeoniflorin)、胡椒堿(piperine)、青藤堿(sinomenine)在調控胞葬作用方面表現出明顯的潛力，成為調節劑的可能性較大。研究顯示，這8個活性成分均具有調控炎癥反應的作用[12-18]，除了青藤堿外其余7個活性成分還可調控巨噬細胞的吞噬作用[18-23]，說明這些活性成分的功能作用與胞葬的作用機制相吻合，驗證了本研究的預測結果。同時值得注意的是，網絡中另一個活性成分花生四烯酸(arachidonic acid)，其度值雖小，但已被證明是一個具有胞葬作用的抑制劑，它可通過活化Rho誘導細胞形態變化，從而抑制巨噬細胞的胞葬作用[24]。此外，網絡中多種活性成分如槲皮素、胡椒堿等在植物類食品中也被發現，提示本研究所預測的結果可為胞葬作用功能障礙相關疾病的食療提供一定的研究思路與依據。

分子對接技術可快速有效地預測指定蛋白與配體之間的結合模式和結合自由能，進而指導研究者對其功能及作用機制進行深入探索研究[25，26]。本研究分子對接的結果顯示，39對“活性成分-作用靶點”關系對的結合自由能均小于-5.0 kcal/mol，這提示中藥活性成分與胞葬作用潛在靶點之間具有良好的結合力；其中Baicalein-ALOX12、Triptolide-CD274、Quercetin-NFE2L2的結合自由能均小于-9.5 kcal/mol，這3對關系對相互之間大多以氫鍵的形式結合，表現出最強的結合能力，具有深入開發研究的價值。研究顯示，黃芩素(Baicalein)為ALOX12的天然選擇性抑制劑[27]，雷公藤甲素(triptolide)能負性調控CD274的表達[28]，槲皮素(quercetin)可正性調控NFE2L2的表達[29]。這些研究進一步驗證了網絡藥理學預測的“活性成分-作用靶點”關系對的可靠性。

在中藥篩選方面，網絡藥理學預測共有368味中藥與胞葬作用相關聯，其中半枝蓮、木蝴蝶、苦參、白果、葛花、紅花、黃柏、麻黃、牛膝、山豆根的度值均在5以上，其所關聯的胞葬作用潛在靶點均在9個以上，提示這10味中藥在調控胞葬作用方面表現出較大的潛力，尤以半枝蓮最為重要。頻次頻率分析結果顯示，與胞葬作用相關的中藥大都歸肝經、肺經，藥味多為苦、辛，藥性以寒、溫為主，這提示胞葬作用的機制與中醫肝經、肺經、味苦、味辛、性寒、性溫的關系密切相關。中醫陰陽五行學說認為，肺屬金，金曰從革，有沉降、肅殺、收斂等性質或作用，為陽中之陰；肝屬木，木曰曲直，有生長、升發、條達、舒暢等性質或作用，為陰中之陽。這一理論認識與頻次頻率分析的與胞葬作用相關聯的368味中藥性味歸經規律結果不謀而合。此外，中醫學認為肝藏血主疏泄，肺朝百脈主治節，兩者的相互作用關系集中體現在調控全身氣機升降和氣血運行方面，因此胞葬作用功能障礙的中醫病機可能為氣機不暢、氣血失和，遣方用藥時需注重調暢氣機、調和氣血。

綜上所述，本研究以胞葬作用這一方興未艾的疾病表型為切入點，利用網絡藥理學、分子對接、數據挖掘方法，較為系統地探討了中藥干預胞葬作用潛在的藥效物質基礎及其用藥規律，發現與調控胞葬作用相關的中藥大多歸肝經、肺經，性味多為寒、溫、苦、辛，中藥活性成分多屬于黃酮類化合物、生物堿和萜類化合物。本研究結果在一定程度上可為中醫臨床遣方用藥治療胞葬作用功能障礙相關疾病以及進一步開展探索性實驗研究提供了借鑒，助力中醫藥現代化研究。由于分子對接等信息技術的不全面以及網絡藥理學所采用的數據庫未能實時更新，可能會導致研究預測結果的客觀性、精準性與實際情況出現偏頗；此外，本文尚未兼顧中藥炮制、煎煮等處理對中藥所含化合物之間相互作用的影響。因此，本研究在一定程度上具有一定的局限性，其結果仍需后續基礎實驗和臨床試驗研究的進一步觀察與佐證。