黃芩素對痤瘡模型大鼠局部組織IL-4、MMP-9的影響?

劉 婧，朱 鵬，鄭 婷，謝 千，郭斐斐，牛凡紅，王思農

(甘肅中醫藥大學，蘭州 730000)

痤瘡是一種毛囊皮脂腺的炎癥性疾病，好發于青少年，其患病率為82.9%，臨床表現為面頰部、胸背部的粉刺、炎性丘疹、結節、膿皰，易反復發作，遷延不愈，預后常遺留瘢痕影響患者的生活質量[1，2]。本實驗通過外用黃芩素治療模型大鼠耳廓復合痤瘡，對局部組織進行HE染色觀察及ELISA法檢測組織中IL-4以及MMP-9的含量，以探究黃芩素干預痤瘡發生發展的作用機制。該研究經甘肅中醫藥大學倫理委員會批準，倫理批準編號2018-116。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雌雄各半的Wistar大鼠64只，體質量(160±20)g，7～9月齡，由甘肅中醫藥大學科研動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(甘)2015-0002。飼養于濕度45%～55%、溫度21 ℃～25 ℃的環境中，以標準鼠飼料及無菌水飼養，動物福利按照國際相關實驗動物法規實施。

1.2 藥物

黃芩素(批號ZY20190927)，由南京源植生物有限公司提供；凡士林(批號Q1402ALX172)，由山東利爾康醫療科技股份有限公司提供；50%油酸溶液(批號H20171201)，由無錫市亞泰聯合化工有限公司提供；0.025%維A酸乳膏(批號H37023768)，由山東良福制藥有限公司；IL-4ELISA試劑盒(批號MM-0191R1)，由江蘇酶免實業有限公司提供；MMP-9ELISA試劑盒(批號MM-20918R1)，由江蘇酶免實業有限公司提供。

1.3 主要儀器

電子天平(蘇州坤宏電子有限公司，型號BMB124)；超低溫保存箱(海爾集團，型號DW-25W518)；酶標儀(上海酶聯生物科技有限公司，型號SP-Max2300A2)；高速冷凍離心機(河南北弘儀器有限公司，型號TGL16 M)；電動離心機(常州市光合有限公司，型號LD34)；顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司，BA400Digital)。

1.4 方法

1.4.1 造模方法與分組 將64只雌雄各半的大鼠按隨機數字表法抽取10只作為空白組，對剩余54只大鼠用kligman法建立右耳廓復合痤瘡模型[3]，即在大鼠右耳內側面耳導管開口處每日涂50%油酸溶液1次，每次0.5～1 mL，隔日于大鼠耳廓皮內注射痤瘡丙酸桿菌菌液，連續3周。左耳不做任何處理，以作對比。待第22天時觀察大鼠耳廓皮損形態，右耳造模部位出現紅腫，皮溫升高，肉眼可見擴張的毛細血管、毛孔增大、脫屑及丘疹樣隆起或囊腫，觸之皮損處粗糙干燥，并參考痤瘡模型判定分級標準[4]，提示復合痤瘡模型已形成。隨機抽取4只進行病理切片觀察，病理提示造模成功后，將剩余50只大鼠隨機平均分為模型組、黃芩素高、中、低劑量組以及陽性對照組。

1.4.2 給藥治療 分組完成后開始給予造模處藥物治療，以凡士林為基質將黃芩素混合于其中，根據人與實驗動物等效劑量換算得出：黃芩素低劑量組給予0.04 g生藥/cm2·d，中劑量組給予0.08 g生藥/cm2·d，高劑量組給予0.16 g生藥/cm2·d，陽性對照組0.025%維A酸給予5 g/cm2·d，將藥物均勻地涂抹于痤瘡模型處，范圍約1 cm×1 cm，厚度約1 mm，每日給藥1次，給藥完成后固定于鼠板20 min，連續4周。空白組和模型組均不涂抹任何藥物。

1.5 形態學及組織學觀察

每日肉眼觀察并記錄大鼠耳廓造模處用藥前后皮損情況，末次用藥24 h后，大鼠經3%的戊巴比妥麻醉后剪下一半右耳用HE染色處理，光鏡下觀察病理學組織形態，采集標本后行頸椎脫臼法處死各組動物。

1.6 細胞因子檢測

取剩余的一半右耳進行皮膚組織勻漿細胞因子檢測，用預冷PBS溶液將大鼠右耳皮膚中的血液洗凈研碎后晾干放于EP管，加PBS勻漿(組織∶PBS體積比為1∶100)，離心后取上清液，用酶聯免疫吸附法檢測IL-4、MMP-9的含量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 肉眼觀察用藥后各組大鼠皮損變化

圖1示，空白組耳廓柔軟光滑，毛細血管清晰可見，模型組皮損處可見紅腫、脫屑及丘疹樣隆起或囊腫，毛細血管擴張，觸之皮溫升高，粗糙干燥。陽性對照組可見輕度紅腫，脫屑減輕，皮損部位溫度降低，毛細血管及毛孔稍有縮小。高劑量組可見皮損處恢復光滑柔軟，毛孔縮小，可見清晰的毛細血管，溫度與空白組基本一致，中劑量組與陽性對照組大致一致，皮損處紅腫減輕溫度降低，脫屑緩解，皮損處柔軟，低劑量較模型組改善效果不顯著。

注：a.空白組；b.模型組；c.陽性對照組；d.低劑量組；e.中劑量組；f.高劑量組圖1 肉眼觀察用藥后各組大鼠皮損比較

2.2 病理學觀察各組大鼠用藥后右耳廓皮損變化

圖2示，光鏡下可見空白組耳廓厚度均一，皮下膠原纖維排列較為致密，毛囊及皮脂腺未見組織學改變，真皮及表皮界限清晰，脂肪組織清晰可見。模型組可見，表皮層增厚，角栓堵塞，毛囊增大，真皮層內皮脂腺增生，皮下間質內形成明顯壞死灶，皮下組織內炎性壞死灶形成，中性粒細胞及淋巴細胞浸潤。陽性對照組與中劑量表皮層厚度較為均一，角化物減少，炎性細胞及纖維壞死也較模型組減少。高劑量組表皮層較薄，炎性細胞基本消失，纖維組織減少。低劑量組表皮層較增厚，纖維組織增生，伴有中性粒細胞及淋巴細胞浸潤。

注：a.空白組；b.模型組；c.陽性對照組；d.低劑量組；e.中劑量組；f.高劑量組圖2 各組大鼠耳部組織炎癥改變比較(HE×100)

2.3 ELISA法檢測痤瘡模型大鼠局部組織中IL-4、MMP-9含量

表1示，模型組與空白組比較，IL-4、MMP-9含量顯著上升，差異有統計學意義(P<0.05)；黃芩素低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠組織中IL-4、MMP-9的含量與模型組比較均有不同程度降低，差異有統計學意義(P<0.05)，各組含量趨勢為高劑量組<陽性對照組<中劑量組<低劑量組。

表1 各組痤瘡模型大鼠局部組織中IL-4、MMP-9含量比較

3 討論

現代醫學認為，痤瘡的發生與皮脂腺功能亢進、毛囊角化過度、雄激素水平異常、痤瘡丙酸桿菌感染、炎癥相關[5]。特異性免疫反應與痤瘡的發生發展聯系密切，其中Th2細胞分泌的IL-4在免疫和炎癥反應中發揮了重要作用[6]，IL-4與痤瘡的嚴重程度呈正比，且臨床研究表明IL-4與患者的痤瘡瘢痕有密切聯系[7，8]。金屬蛋白酶(MMPs)屬于鋅依賴性內肽酶，存在于細胞外基質中。在痤瘡患者的皮損組織中，MMP-2、MMP-3 以及 MMP-9呈現高表達，MMPs的高表達可以加速皮膚膠原纖維的降解，最終導致瘢痕形成[9]。

《素問·生氣通天論篇》曰：“勞汗當風，寒薄為皶，郁乃痤。”外邪、痰濕、血熱致玄府閉塞，郁火內生，升降悖逆，氣液失運，變生痰瘀，漸成結節，觸之腫硬疼痛或按之如囊[10]。黃芩性苦、寒，有清熱燥濕、安胎止血之效[11]，黃芩素是黃芩的主要成分之一，屬于5，6，7-三羥基黃酮，因其化學性質活潑，水溶性較差[12]，故本實驗以凡士林為基質。現代藥理研究發現，黃芩素可通過抑制iNOS、COX-2、NO、IL-6等因子的釋放，從而減輕炎癥[13]，或通過抑制髓樣分化因子-2(MD-2)/TLR4復合物的形成以及炎癥小體的激活，降低促炎介質表達[14]。羅曉平等[15]發現，黃芩素能夠干預AKT/NF-κB通路磷酸化蛋白表達而抑制該通路激活，減少炎癥因子釋放。并可通過內質網應激CHOP/STAT途徑抑制細胞因子、趨化因子和生長因子，對雙鏈RNA誘導的巨噬細胞起到抗炎作用[16]。在體外細胞模型實驗中發現，黃芩素可通過NF-κB和Wnt/b-catenin信號通路調控miR-9/IGF-1軸，抑制成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的產生，從而達到治療瘢痕的作用[17]，或作用于microRNA-29激活p38 MAPK-JNK通路，以延緩膠原的過度增殖和沉積，從而治療增生性瘢痕[18]。黃芩素亦可抑制MMP-2、MMP-9和組織蛋白酶來防止膠原降解[19]。此外黃芩素還具有抗菌[20]、抗氧化[21]、抗腫瘤作用[22]。紅細胞溶血實驗表明，黃芩素對眼睛無刺激性，對人體作用溫和[23]。

本實驗研究發現，黃芩素可能通過降低痤瘡模型組織中IL-4、MMP-9的含量，進而調控炎性介質的發展并減少后期痤瘡瘢痕的形成。在臨床診療的過程中，西醫治療痤瘡容易反復，且存在使皮膚干燥、瘙癢、疼痛、色素沉著等副作用[24]。而中藥口感較差，有些患者不愿長期服用。外用黃芩素治療痤瘡療效確切，在臨床中有較好的應用前景。