Caspase家族與心血管疾病及中藥復方的干預研究?

楊 光，何浩強,2，周思遠，王 階

(1.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053；2.北京中醫藥大學，北京 100029)

近年來，心血管疾病的殘余風險使降脂聯合抗炎的治療策略備受關注[1]。隨著卡納單抗、MCC950為代表的靶向抗炎藥物取得突破性進展，人們開始探索更為有效的干預靶點。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)是固有免疫與細胞凋亡多條信號通路中的“關鍵元件”。既往關于Caspases的認識主要集中在調控細胞凋亡方面，近年來人們發現，Caspases還可介導細胞焦亡引起的炎癥反應，廣泛參與動脈粥樣硬化等心血管疾病的發生發展。另一方面，Caspases調控細胞凋亡的理論也日漸豐富。該文檢索國內外文獻，闡述Caspases的科學內涵及其與心血管疾病的聯系，并對近5年中藥復方針對Caspases干預心血管疾病的研究報道進行述評。

1 Caspase家族簡述

Caspase是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的簡稱，能特異性地切割靶蛋白的天冬氨酸殘基的肽鍵。Caspases一般以酶原(pro-Caspase)的形式存在于細胞質中，pro-Caspases與反應物特異性結合后，可通過自體切割的形式釋放有生物活性的Caspases。成熟Caspases也可由其他Caspases活化產生。Caspase家族共有14個成員，根據其生物學功能，可分為炎癥Caspases、凋亡Caspases及其他功能不明確的Caspases[2]。炎癥Caspases指Caspase-1/4/5/11，介導細胞焦亡發生。凋亡Caspases包括凋亡起始Caspases與凋亡效應Caspases。起始Caspases包括Caspase-8/9/10，效應Caspases包括Caspase-3/6/7，但其分類目前仍沒有定論。炎癥Caspases一般含有CARD結構域，是募集炎癥小體的必要結構。凋亡起始Caspases含有DED結構域，是組裝死亡信號復合體的結構之一。Caspases分子間的相互激活及參與的信號傳導通路(圖1)。

圖1 Caspases參與細胞凋亡與細胞焦亡的作用通路

1.1 Caspase-1介導經典細胞焦亡途徑

細胞焦亡是一類壞死性和炎癥性的細胞程序性死亡，最主要的特征是穿孔素(Gasdermin D,GSDMD)在細胞膜表面形成“孔道”引起大量胞內容物的外流(如炎性因子等)，導致細胞的滲透性溶解及炎癥反應的擴大[3]。根據啟動元件——炎癥小體的不同，細胞焦亡可分為依賴Caspase-1的經典途徑和依賴Caspase-4/5/11的非經典途徑2種方式。

炎癥小體是免疫細胞內多種蛋白質組成的復合體，存在于細胞質中，一般由3個部分組成，如受體蛋白、銜接蛋白以及效應蛋白。炎癥小體的名稱一般以其受體部分的名稱代指。NOD樣受體蛋白3(nod-like receptor pyrin domain3,NLRP3)、黑色素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2,AIM2)等受體在接收到配體的信號后，通過PYD或CARD結構域募集銜接蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)，形成的二聚體通過自身的CARD結構域與pro-Caspase-1的CARD結構域結合形成炎癥小體。炎癥小體被激活后通過自身剪切產生效應蛋白Caspase-1[3]。NLRP3是研究最多的炎癥小體，可被多種病原相關分子模式或損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMPs)激活，在固有免疫系統中發揮了重要作用[4]。Caspase-1形成后一方面裂解GSDMD產生其氨基端肽段。GSDMD-N插入細胞膜中形成20 nm左右的小孔，破壞細胞膜的完整性引發細胞焦亡[5]；另一方面Caspase-1剪切白細胞介素(interleukin，IL)的前體，形成活化的IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18誘導一系列細胞因子和趨化因子產生，進一步募集炎癥細胞，擴大炎癥反應。

1.2 Caspase-4/5/11介導非經典細胞焦亡途徑

非經典炎癥小體可看作是經典炎癥小體的補充，因其能繞過Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)4、Nod樣受體及Caspase-1參與細胞焦亡而得名[6]。非經典炎癥小體以Caspase-4/5/11為核心，不需要銜接蛋白，本身即可對各種細菌作出免疫應答，甚至被認為是一種新的模式識別受體[7]。目前關于Caspase-11的研究較深入，其在應答細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)時有兩種激活模式。細胞外的LPS活化TLR4，通過β干擾素TIR結構域銜接蛋白、1型干擾素等信號通路促進pro-Caspase-11表達，進而釋放活性Caspase-11[8，9]；細胞內形成囊泡的LPS直接被Caspase-11識別，通過兩者共有的CARD結構域誘導Caspase-11產生活性。Caspase-11也能特異性剪切GSDMD，產生GSDMD-N，故可引發細胞焦亡。另有研究認為，Caspase-11通過促進K+外流，參與NLRP3炎癥小體的組裝，導致細胞焦亡反應進一步擴大[10]。

1.3 Caspase-8/10參與外源性細胞凋亡途徑

細胞凋亡不同于細胞焦亡，是機體清除衰老、損傷細胞，維持穩態的重要機制，但某些情況下凋亡也會導致繼發性的病理損害。細胞凋亡包括3種信號傳導途徑，如死亡受體介導的細胞外途徑、線粒體介導的細胞內途徑和內質網應激途徑。

在細胞外，機體給細胞下達的“死亡指令”通過死亡配體傳達給死亡受體，繼而傳到細胞內引起Caspase-8/10的活化。一些常見的死亡配體及受體包括Fas配體/受體(FasL/FasR)、腫瘤壞死因子配體/受體(TNF-α/TNFR1)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體/受體(TRAIL/DR4)等[11]。以Fas受體為例，當細胞被病毒刺激后，細胞毒性T細胞分泌FasL，FasR與之結合發生構象改變，募集包漿內Fas相關接頭蛋白(FADD)。FADD分子的C端通過自身DD結構域與FasL/FasR復合體相連，N端通過死亡效應結構域(DED)吸引同樣含有DED的pro-Caspase-8，形成由FasL、FasR、FADD、pro-Caspase-8組成的死亡誘導信號復合體[12]。Pro-Caspase-8在復合物中釋放Caspase-8，Caspase-8再作用于下游的酶原，活化Caspase-3、Caspase-7，執行凋亡事件。雖然Caspase-8和Caspase-10在結構上有很高的同源性，功能也類似，但是具有不同的底物特異性，不可相互替代[13]。

1.4 Caspase-9參與內源性細胞凋亡途徑

線粒體響應細胞內產生的應激信號，由線粒體蛋白決定細胞是否進入凋亡程序。線粒體蛋白主要是B細胞淋巴瘤-2(B-cell leukemia-2,Bcl-2)家族蛋白，Bcl-2家族分為抑制凋亡的Bcl-2亞族及促進凋亡的Bcl-2相關X蛋白(Bcl2 associated X protein,Bax)、Bcl-2相關K蛋白(Bcl2 associated K protein,Bak)亞族等[14]。Bcl-2家族通過彼此間的聚合和解聚，改變線粒體外膜通透性，線粒體外膜通透性增加后，線粒體膜間隙蛋白成分如細胞色素C(Cytc)、第2個線粒體衍生半胱氨酸蛋白酶激活因子(SMAC)、絲氨酸蛋白酶(Omi)被釋放到細胞質中，成為點燃細胞凋亡的”導火索”。Cytc在胞質中與凋亡酶激活因子-1(Apaf-l)結合形成凋亡復合體[15]，暴露出CARD結構域吸引pro-Caspase-9，Caspase-9經SMAC、Omi活化后脫離激活下游的Caspase-3/7，執行細胞凋亡。細胞凋亡的內外途徑并不是相互孤立的，通過死亡受體途徑活化的Caspase-8可以間接激活下游的線粒體途徑。Caspase-8能剪切Bcl-2家族中的一種促凋亡蛋白(Bid)，切割產生的Bid片段會轉移到線粒體外膜,與外膜結合并激活膜上的Bax和Bak，引起線粒體外膜通透性增加和Cytc等促凋亡物質釋放[16]。

1.5 Caspase-12參與內質網應激介導的凋亡通路

內質網是蛋白質折疊、修飾和轉運的重要場所，但只有折疊正確的蛋白質才能從內質網轉運至高爾基體，折疊錯誤或未折疊的蛋白質則通過內質網的降解通道引發應激反應。適度的內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，有助于異常蛋白質進行正確折疊，轉運出去發揮正常的生物學效應，超負荷的ERS則通過蛋白激酶樣內質網激酶、肌醇依賴性激酶1α(inositol requiring enzyme1α，IRE1α)、活化的轉錄因子6三條信號通路引發細胞凋亡[17]。Caspase-12位于內質網的表面，是IRE-1α通路的效應蛋白，基因突變、氧化應激、缺血缺氧等生理或病理刺激可能導致蛋白質折疊出現異常，繼而觸發ERS，形成IRE-1α-腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)復合體。TRAF2誘導pro-Caspase-12并與之結合，Caspase-12從復合物中解離出來，經過級聯反應激活Caspase-3及Caspase-7。Caspase-3與Caspase-7是細胞凋亡的終末剪切酶，可被內源性、外源性、內質網應激3種途徑激活，降解各種細胞骨架蛋白、核蛋白，發揮促凋亡作用[18]。

2 Caspase家族與心血管疾病

2.1 炎癥Caspases與心血管疾病

Caspases-1介導的細胞焦亡與心血管疾病的炎性過程密切相關。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病，現已發現膽固醇晶體、氧化的低密度脂蛋白等刺激物可激活巨噬細胞或內皮細胞中的NLRP3-Caspases-1通路，促進AS炎癥反應的發生[19，20]。在頸動脈粥樣硬化的斑塊中也發現，NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18較健康的腸系膜動脈明顯增加，且不穩定斑塊中上述指標的表達水平比穩定性斑塊更高[21]。1項臨床研究證實，冠心病患者外周血中的NLRP3水平高于非冠心病患者，阿托伐他汀可能通過經典細胞焦亡途徑降低IL-1β、IL-18水平[22]。高血壓也與Caspases-1存在相關性，可能導致某些DAMPs水平升高，而這些DAMPs又會激活 NLRP3炎癥小體[23]。1項實驗發現，NLRP3抑制劑MCC950能有效降低血壓，抑制腎臟炎癥、纖維化和功能障礙[24]。心力衰竭是多種心血管疾病的終末階段，研究表明NLRP3可產生心臟重塑作用，加重心衰過程[25]。另外，心房顫動常伴有炎癥反應增強。有研究發現，慢房顫患者心肌細胞中Caspase-1、NLRP3、ASC水平增加，快房顫患者的Caspase-1-p20水平增加[26]。相較于Caspases-1，Caspases-4/5/11在心血管領域的研究相對匱乏，目前并未有直接證據表明其參與心血管疾病的發生發展。

2.2 凋亡Caspases與心血管疾病

巨噬細胞、心肌細胞、血管平滑肌細胞凋亡在AS、心肌缺血/再灌注損傷、心肌病、心衰和心律失常的作用于上世紀90年代已形成初步認識[27]，凋亡Caspases與內質網應激的發現使相關理論變得更加成熟。研究發現，內質網應激參與了AS晚期巨噬細胞凋亡形成斑塊的病理過程[28]。高血壓誘導的氧化應激會激活內質網應激，繼而誘發心肌細胞凋亡，形成高血壓早期的心肌肥厚和晚期的舒張性心力衰竭[29]。Caspase-12是調控內質網應激的關鍵蛋白，在心肌缺血/再灌注損傷、心力衰竭、心臟肥大的過程中也會出現Caspase-12的高表達[30]。Caspase-3是細胞凋亡的終末蛋白，既往研究表明Caspase-3升高見于AS、心肌缺血、心肌病、心力衰竭[31]。此外，Caspase-3與心肌梗死關系密切。1項研究納入27例接受心臟介入手術的急性心梗患者，發現心梗急性期、梗死后及健康對照組的血清Caspase-3p17肽段水平(中位數及四分位數)依次降低，峰值期的p17肽段水平與cTnI、CK-MB呈正相關[32]。動物實驗表明，抑制Caspase-3表達能降低梗死面積和心肌細胞的凋亡指數，改善心臟功能[33]。

3 中藥復方干預Caspases的研究進展

中藥復方能調節Caspases及上下游分子的表達，從而干預細胞焦亡與細胞凋亡途徑。這為中藥治療心力衰竭、冠心病、高血壓的機制研究提供了新的科學依據(見表1)。

表1 中藥復方干預Caspase的研究進展

3.1 心力衰竭

中藥復方可通過細胞凋亡的3種途徑干預心力衰竭。1項研究觀察參附益心方對受損心肌細胞的影響，發現該方除使線粒體數量增加、活性增高外，還可從基因和蛋白水平降低Caspase-3、Caspase-9、Bax的表達，促進Bcl-2的表達，但對Caspase-8的表達則無明顯的下調作用[34]。1項研究用補益強心片治療缺血誘導的心衰大鼠，同時檢測磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)的表達，結果顯示它可以激活PI3K-Akt信號通路，同時抑制Bax、Caspase-3的表達[35]。1項研究探討芪參益氣湯治療心衰大鼠的作用機制，發現芪參益氣湯可升高mi-RNA133a及其下游蛋白Bcl-2、Caspase-9的表達水平[36]。在1項關于益氣瀉肺湯的實驗中，益氣瀉肺湯低劑量組觀察到抑制Bax表達，中劑量組可上調Bcl-2蛋白表達，高劑量組降低了Caspase-3的表達[37]。進一步的研究表明，益氣瀉肺湯干預心衰是通過抑制TLR4受體/核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)蛋白介導的炎癥通路及Caspase-8介導的細胞外凋亡通路、Bax蛋白介導的細胞內凋亡通路發揮作用的[38]。另外研究表明，降糖舒心方[42]、強心膠囊[43]對Caspase-12的表達有抑制作用，可能通過內質網應激減輕細胞凋亡，其他干預Caspase-3/9的中藥復方還有心康沖劑[39]、參桂寶心方[40]、真武湯[41]、參桂保心濃煎劑[52]。

3.2 動脈粥樣硬化與冠心病

內皮損傷和脂質沉積引發的炎癥反應是AS的病理基礎，巨噬細胞焦亡擴大炎癥反應，平滑肌細胞凋亡破壞斑塊的穩定性，中藥復方可有效干預上述環節。清心解瘀方是陳可冀院士治療心肌梗死的經驗方，研究證實清心解瘀方可調控巨噬細胞焦亡和炎癥級聯反應，涉及20余條信號通路。清心解瘀方通過下調Caspase-1、NLRP3、DSDMD-N的表達，減少主動脈斑塊中巨噬細胞浸潤和脂質沉積，改善機體炎癥狀態和脂質代謝[44]。1項實驗探討溫腎化痰方對動脈硬化小鼠的治療作用，結果表明經溫腎化痰方干預后，各中藥組的Caspase-3、Caspase-9、Bax表達均降低，而Bcl-2表達增加。且這種變化呈濃度依賴性，高劑量溫腎化痰方干預后的基因表達與空白對照組無明顯差異，說明溫腎化痰方通過抑制血管平滑肌細胞凋亡，改善AS斑塊的形成及發展[45]。與之類似，穩斑湯能降低小鼠主動脈組織中Caspase-3、Bax的基因及蛋白表達，改善不穩定斑塊的形成和破裂情況[46]。1項研究探討瓜蔞薤白半夏湯合血府逐瘀湯治療心肌缺血損傷的作用機制。該研究表明，痰瘀同治能誘導Bcl-2的表達，抑制Bax的表達，并能抑制Caspase-3、Caspase-9的蛋白酶活性[47]。可見，中藥復方可通過經典炎癥小體途徑與線粒體介導的凋亡途徑改善心肌供血及穩定/不穩定斑塊的形成和發展。

3.3 高血壓及相關代謝紊亂

中藥復方可通過細胞焦亡與細胞凋亡途徑干預高血壓病的左室肥厚及代謝紊亂。三草降壓湯是劉渡舟教授治療高血壓的經驗方。1項實驗通過NF-κB及NLRP3-IL-1β信號通路研究三草降壓湯的作用機制，結果顯示三草降壓湯高、中劑量組可降低血清IL-1β、心臟組織中NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、IL-1β基因及蛋白表達。研究者認為，三草降壓湯的降壓及保護靶器官作用正是通過其抗炎作用發揮的，且這種作用優于卡托普利[48]。1項研究通過“血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)-ERS”通路觀察活血潛陽祛痰方對高血壓左室重構大鼠的治療作用，治療后大鼠心肌組織中葡萄糖調節蛋白78(GRP78)、Caspase-12表達下調。作者認為中藥改善大鼠的血壓、糖脂指標及左室重構的作用，可能與其調控心肌局部AngⅡ-GRP78-Caspase-12凋亡通路有關[49]。針箭顆粒由清肝滋腎中藥組成，1項研究通過沉默調節蛋白1(sirtuin 1,Sirt1)探討針箭顆粒Ⅱ號治療高血壓代謝紊亂的作用機制。Sirt1蛋白是Caspase-1的底物，Caspase1能選擇性剪切Sirt1，使其表達降低。研究發現，針箭顆粒干預后，大鼠肝臟組織Caspase-1蛋白表達下調，Sirt1蛋白表達上調[50]。1項研究觀察天麻鉤藤飲對Bax、Caspase-3蛋白表達的影響，發現天麻鉤藤飲能明顯降低收縮壓、AngⅡ及醛固酮水平，并使心肌組織的Bax、Caspase-3蛋白表達降低[51]。

4 小結與展望

Caspase家族包括炎癥Caspases與凋亡Caspases，參與固有免疫與細胞凋亡過程中的多條信號通路。Caspase-1介導的經典細胞焦亡途徑與Caspase-3/7/8/9/10/12介導的凋亡途徑在AS、冠心病、高血壓、心力衰竭、心律失常等疾病中發揮重要作用。Caspases-1在 AS中的作用機制已得到初步闡明，但同樣介導細胞焦亡的Caspases-4/5/11在AS中作用尚不清楚，有待進一步探索。炎癥Caspases為冠心病的靶向“抗炎療法”提供了新的思路，有望成為新的干預策略和治療靶點。盡管目前已有較多關于Caspases家族成員與心血管疾病關系的研究，但這些研究多是相關性研究，還需要深入探索兩者之間的作用機理。近5年來，中藥針對Caspases干預心血管疾病的研究逐漸增多，主要集中在心力衰竭、動脈粥樣硬化性疾病、高血壓相關代謝紊亂上。中藥復方能夠調控Caspases及其上下游分子的表達，有利于從細胞焦亡與細胞凋亡角度闡釋其對心血管疾病的治療作用。但是，目前的研究多針對單一Caspases進行檢測，反映的是中藥對“單靶點、單通路”的治療效果，未來的研究可同時開展對多種Caspases成員的檢測，以明確中藥作用機理，進一步闡明中醫方證內涵。