可溶性環(huán)氧化物水解酶與肝臟疾病*

周露萍， 陳露露， 歐陽冬生，△

（1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，2復(fù)雜基質(zhì)樣本生物分析湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3長沙都正生物科技有限責(zé)任公司，湖南長沙410000）

可溶性環(huán)氧化物水解酶（soluble epoxide hydro?lase，sEH）是一種雙功能同型二聚體酶，于1973年被Gill等［1］在研究類似昆蟲保幼激素萜類環(huán)氧化物的代謝時發(fā)現(xiàn)，因其主要定位于細(xì)胞可溶性組分而得名。近年來大量研究表明，sEH在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和代謝性疾病等多種疾病中發(fā)揮著重要作用［2-4］，已被作為疾病治療的新靶點(diǎn)而進(jìn)行研究，且已有sEH抑制劑進(jìn)入了人體臨床試驗(yàn)。本文綜述了sEH與肝臟疾病之間的關(guān)系，以期為sEH作為肝臟疾病治療新靶點(diǎn)的研究提供參考。

1 sEH的結(jié)構(gòu)

sEH普遍存在于哺乳動物體內(nèi)，現(xiàn)階段對人源和鼠源sEH的研究較為深入。人源sEH由位于人類8號染色體p21.2-p21.1區(qū)域的EPHX2基因編碼，包含19個外顯子和18個內(nèi)含子，共編碼555個氨基酸殘基。小鼠和大鼠的sEH編碼基因Ephx2分別位于14和15號染色體，均可編碼554個氨基酸殘基，與人類sEH的同源性為73%。

哺乳動物中的sEH由兩個單體以反向平行的方式構(gòu)成，每個單體由含有典型α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)的C端水解酶結(jié)構(gòu)域、N端磷酸酶結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的柔性連接區(qū)域組成［5］。C端結(jié)構(gòu)域和N端結(jié)構(gòu)域中各包含一段過氧化物酶體靶向信號（peroxi?somal targeting signal，PTS），分別是受損的PTS-1和潛在的PTS-2［6］。

2 sEH的分布

sEH廣泛分布于哺乳動物的各組織器官中，尤其在肝、腎、腸和血管系統(tǒng)中的活性較高［7-8］。關(guān)于sEH的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，早期研究均認(rèn)為其定位于過氧化物酶體中，但就其是否可定位于胞漿中未能達(dá)成一致意見［9-12］。隨著生命科學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)sEH的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位具有組織和細(xì)胞類型依賴性［6］，sEH的二聚體狀態(tài)被認(rèn)為是其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位的一個關(guān)鍵影響因素，具有完整二聚體形式的sEH優(yōu)先定位于胞漿中，而二聚體結(jié)構(gòu)受到破壞的sEH則優(yōu)先靶向過氧化物酶體［13］。此外，有研究者在尿液外泌體中檢測到了sEH蛋白［14］，但還需開展更多的研究來考察sEH是否存在于外泌體中。

3 sEH的功能

哺乳動物中的sEH包含C端水解酶和N端磷酸酶兩個功能結(jié)構(gòu)域。目前，C端水解酶結(jié)構(gòu)域特征及其生物學(xué)功能的研究較為深入，該活性中心對環(huán)氧脂肪酸具有高度選擇性，能將環(huán)氧脂肪酸快速水解為其對應(yīng)的二醇類化合物；而N端磷酸酶結(jié)構(gòu)域的研究尚處于起步階段，最初的研究認(rèn)為其主要功能是參與維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，至2003年才被證實(shí)具有磷酸酶活性，隨后的研究發(fā)現(xiàn)該活性中心主要參與了膽固醇代謝的調(diào)控［15-16］。

3.1 環(huán)氧化物水解酶活性 C端結(jié)構(gòu)域含有經(jīng)典的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)，具有環(huán)氧化物水解酶活性，可催化環(huán)氧化合物代謝成二醇類化合物，從而發(fā)揮解毒作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)sEH可催化白細(xì)胞毒素和異白細(xì)胞毒素代謝為毒性代謝產(chǎn)物，白細(xì)胞毒素經(jīng)sEH代謝后生成的白細(xì)胞毒素二醇可導(dǎo)致嚴(yán)重?zé)齻颊叱霈F(xiàn)多器官功能衰竭和成人呼吸窘迫綜合征［17-18］。

此外，sEH的主要生理作用是將具有較強(qiáng)抗炎活性的環(huán)氧脂肪酸，例如花生四烯酸來源的環(huán)氧二十碳三稀酸（epoxyeicosatrienoic acid，EETs）和二十二碳六烯酸來源的環(huán)氧二十碳五烯酸（epoxydocosa?pentaenoic acids，EDPs）代謝為無活性或低活性的二元醇類化合物［19］。EETs具有擴(kuò)張血管、降低血壓、抗炎、線粒體保護(hù)等多種生物學(xué)功能，抑制sEH是提高EETs生物活性的一種重要途徑。因此，干擾sEH活性已成為心血管疾病和炎癥性疾病的理想治療靶點(diǎn)。

3.2 磷酸酶活性 N端結(jié)構(gòu)域的生理作用尚不完全清楚，起初認(rèn)為N端結(jié)構(gòu)域僅參與維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，至2003年才被證實(shí)具有金屬依賴性的磷酸酶活性［15-16］，可將羥基磷酸化的脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇類化合物［20］，其底物主要包括異戊間二烯磷酸鹽（焦磷酸法尼酯、焦磷酸香葉基香葉酯和法尼基單磷酸）、4-硝基苯磷酸鹽、鞘氨醇-1-磷酸和溶血磷脂酸［21］。sEH的N端結(jié)構(gòu)域雖具有磷酸酶活性，但已知的常規(guī)磷酸酶抑制劑不能抑制sEH的磷酸酶活性［15］。

sEH在膽固醇代謝中的作用已被多次報道，但在不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭衧EH磷酸酶活性與膽固醇水平之間呈現(xiàn)出不同的相關(guān)性。穩(wěn)定表達(dá)人源sEH磷酸酶結(jié)構(gòu)域的HepG2細(xì)胞中膽固醇水平升高［22］，而在巨噬細(xì)胞內(nèi)特異性過表達(dá)sEH磷酸酶結(jié)構(gòu)域可抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的膽固醇蓄積［23］。EPHX2基因Arg287Gln多態(tài)性位點(diǎn)顯著升高sEH的磷酸酶活性，該突變位點(diǎn)與家族性高膽固醇血癥患者血漿膽固醇和甘油三酯水平升高以及冠狀動脈鈣化相關(guān)［24-26］。

sEH水解酶結(jié)構(gòu)域?qū)ρ軆?nèi)皮的調(diào)控作用已經(jīng)很明確，近來其磷酸酶結(jié)構(gòu)域也被證實(shí)具有調(diào)控血管內(nèi)皮功能的作用。sEH磷酸酶結(jié)構(gòu)域而非水解酶結(jié)構(gòu)域可明顯抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endo?thelial growth factor，VEGF）的表達(dá)［27］，過表達(dá)sEH磷酸酶結(jié)構(gòu)域可抑制辛伐他汀或VEGF誘導(dǎo)的一氧化氮（nitric oxide，NO）合成和內(nèi)皮型NO合成酶（endo?thelial NO synthase，eNOS）的磷酸化［28-29］。此外，基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)sEH磷酸酶結(jié)構(gòu)域的底物可能參與調(diào)控細(xì)胞黏附分子、血管炎癥以及肝臟防御系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)［30］；sEH基因敲除后導(dǎo)致的小鼠焦慮樣行為可能與sEH的磷酸酶活性相關(guān)［31］。

4 sEH與肝臟疾病

肖佳等［32］于2019年發(fā)表在Journal of Hepatology的文章顯示，我國超過五分之一的人口受到一種以上肝病的影響，特別是乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、肝硬化、肝癌、非酒精性脂肪性肝病（nonal?coholic fatty liver disease，NAFLD）、酒精性肝病（al?coholic liver disease，ALD）和藥物性肝損傷（drug-in?duced liver injury，DILI），肝臟疾病已成為我國疾病率和死亡率的主要影響因素之一。尋找治療肝臟疾病的新思路、新方法迫在眉睫。sEH是一種廣泛分布于各種組織器官的雙功能酶，其主要功能是參與膽固醇和抗炎活性物質(zhì)環(huán)氧脂肪酸類化合物的代謝。在多種動物模型中，通過檢測sEH表達(dá)和活性、使用sEH抑制劑、干擾sEH基因表達(dá)等實(shí)驗(yàn)方法，證實(shí)了sEH在NAFLD、ALD、肝纖維化和部分DILI中發(fā)揮一定作用。目前尚未見到sEH與肝細(xì)胞癌、膽汁淤積性肝病和傳染性肝病之間關(guān)系的研究報道。

4.1 肝臟疾病中sEH的表達(dá)及活性改變 大多數(shù)研究提示，NAFLD、ALD和肝纖維化等肝臟疾病中sEH表達(dá)或活性水平升高［33-39］。但sEH與DILI的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，對乙酰氨基酚和舍曲林可降低肝臟中sEH的mRNA水平［40-41］；氯貝特和丙戊酸鈉則可分別升高肝臟中sEH的mRNA和蛋白水平［42-43］。

NAFLD是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，其病理學(xué)改變與ALD相似，但患者無過量飲酒史，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steato?hepatitis，NASH）、肝硬化和肝細(xì)胞癌［44-46］，影響著全球25%的成年人，目前還沒有發(fā)現(xiàn)有效的藥物治療方法。高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型中sEH表達(dá)水平檢測結(jié)果提示，短期高脂飲食（8周）雖不影響小鼠肝臟中sEH的蛋白水平，但可導(dǎo)致sEH活性顯著升高［34］；長期高脂飲食（16周、5個月和10個月）則可導(dǎo)致小鼠肝臟中sEH的蛋白水平顯著升高［33-34］。高同型半胱氨酸血癥在NAFLD患者中普遍存在，被認(rèn)為是一個重要的危險因素，有研究表明sEH活性和表達(dá)的增加與高水平同型半胱氨酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)蓄積相關(guān)［37］。

近年來由于人們生活習(xí)慣的改變，酗酒和過量飲酒已成為全球公共衛(wèi)生的主要問題之一。ALD是因長期過量飲酒引起的肝臟損傷，早期表現(xiàn)為肝臟脂肪變性，隨著飲酒時間的延長可能發(fā)展為酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化或肝硬化［47］。ALD的治療方案有限，主要是戒酒治療，對于已進(jìn)入不可逆階段的ALD，目前尚無有效的治療方法和治療靶點(diǎn)。Mello等［38］的研究發(fā)現(xiàn)，在ALD小鼠模型中sEH的蛋白和mRNA水平均顯著升高，因此認(rèn)為肝臟sEH表達(dá)失調(diào)可能與ALD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

肝纖維化是NASH、嚴(yán)重性ALD、病毒性肝炎和膽汁淤積性肝病等多種肝臟疾病的病理特征，進(jìn)行性肝纖維化最終會導(dǎo)致肝硬化和肝功能衰竭［48］。在采用50%四氯化碳和橄欖油構(gòu)建的表現(xiàn)為肝纖維化和門靜脈高壓癥的肝硬化模型大鼠中，肝臟sEH蛋白水平顯著升高［39］。

DILI是指藥物和（或）其代謝產(chǎn)物引起的肝臟損害，也被稱為藥物性肝毒性或藥物性肝病［49］，嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性肝衰竭甚至死亡，是臨床上常見的藥物不良反應(yīng)之一以及藥物退出市場的常見原因之一［50-51］。目前，美國國立衛(wèi)生研究院建立的LiverTox數(shù)據(jù)網(wǎng)站已收錄了1 200多種可導(dǎo)致肝損傷的藥物。近年來DILI的發(fā)病率逐年升高，僅次于病毒性肝炎和脂肪性肝病，加之其發(fā)生隱匿和復(fù)雜，因此臨床醫(yī)生和研究人員應(yīng)對DILI予以高度重視。DILI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及藥物代謝、線粒體功能損傷、免疫反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、遺傳和環(huán)境等多個方面［50，52］。雖然sEH在肝臟中高表達(dá)，但目前僅被報道可能與對乙酰氨基酚、舍曲林、氯貝特和丙戊酸鈉的肝毒性相關(guān)：對乙酰氨基酚顯著降低小鼠肝臟sEH的mRNA水平［40］；舍曲林顯著降低兔肝臟sEH的mRNA水平［41］；氯貝特顯著升高小鼠肝臟sEH的mRNA水平［42］；丙戊酸鈉顯著升高大鼠肝臟sEH（P80299）的蛋白水平［43］。由于sEH在肝臟中相對高表達(dá)以及其代謝底物在體內(nèi)廣泛存在，sEH與DILI之間的相關(guān)性值得被重視。

4.2 sEH抑制在肝臟疾病治療中的應(yīng)用 現(xiàn)有的sEH抑制方法分為2種：基因干擾和藥物抑制。研究中常用的sEH抑制劑有t-AUCB｛trans-4-［4-（3-ada?mantan-1-yl-ureido）-cyclohexyloxy］-benzoic acid｝和TPPU［1-trifluoromethoxyphenyl-3-（1-propionylpiperi?din-4-yl）urea］。sEH抑制劑（TPPU和t-AUCB）或敲除sEH基因均可明顯改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化和高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)蓄積［36，53-55］；t-AUCB可明顯減輕高碳水化合物和高脂飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征模型大鼠中的葡萄糖、胰島素和脂質(zhì)異常［56］；TPPU可減輕高同型半胱氨酸血癥引起的肝臟脂肪變 性 和 蛋 氨 酸 膽 堿 缺 乏 飲 食 誘 導(dǎo) 的NASH［37，57］。Warner等［58-59］于2018年發(fā)表的研究結(jié)果顯示，在慢性和慢加急性酒精性肝損傷模型小鼠中，sEH抑制劑t-AUCB可減輕乙醇誘導(dǎo)的肝損傷，表現(xiàn)為血漿轉(zhuǎn)氨酶活性降低和肝細(xì)胞凋亡減少，但肝臟脂肪變性和氧化應(yīng)激未有明顯減輕。但近期的一篇研究認(rèn)為sEH基因干擾或sEH抑制劑TPPU不僅可明顯抑制酒精攝入導(dǎo)致的肝損傷，也能減輕炎癥和肝臟脂肪變性［38］。目前尚未見到使用特異性sEH抑制劑或基因干擾方法，觀察sEH抑制對DILI影響的研究報道。我們前期研究人參皂苷CK減輕丙戊酸鈉肝毒性的時候發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK可明顯抑制丙戊酸鈉誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織sEH表達(dá)上調(diào)，提示sEH可能介導(dǎo)了人參皂苷CK的肝保護(hù)作用［43］，sEH抑制或許可被用于部分DILI的治療。

5 結(jié)語與展望

sEH在心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中已被廣泛研究，但其在肝臟疾病中的作用尚未明確，仍有諸多問題值得研究。比如，sEH抑制在其他肝臟疾病如病毒性肝炎、膽汁淤積性肝病和肝癌中的作用；sEH抑制劑減輕非酒精性脂肪肝的作用是否與膽固醇代謝相關(guān)；sEH的水解酶結(jié)構(gòu)域和磷酸酶結(jié)構(gòu)域分別與肝臟疾病之間的關(guān)系；能否同時對sEH的水解酶活性和磷酸酶活性進(jìn)行不同方向的調(diào)控；sEH編碼基因的多態(tài)性是否與肝臟疾病相關(guān)；sEH是否參與其他藥物的肝毒性發(fā)生；以及sEH抑制劑可能產(chǎn)生的副作用有哪些等。此外，雖然人源和鼠源sEH的同源性較好，但已知兩者的蛋白異構(gòu)體類型之間存在明顯差異，提示在研究sEH時需考慮物種差異的影響。

綜上所述，基于sEH可調(diào)控環(huán)氧脂肪酸和膽固醇的代謝，不難推測sEH在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，但其是否可以成為肝臟疾病治療的靶點(diǎn)，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。