miRNA在阿爾茨海默病中的研究進展

李雪嬌 郎咸圣婕 張憲亮

(山東大學體育學院，山東 濟南 250061)

阿爾茨海默病(AD)是一種多發于老年時期的慢性神經系統疾病，臨床特征為學習、記憶和認知功能下降，病理特征為海馬體萎縮、β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊積聚和神經纖維纏結〔1〕。miRNA是一類長度約有22個核苷酸的微小RNA。多項研究證明，miRNA在腦學習記憶及認知功能的調控中起重要作用，部分miRNA的異常表達及其介導的下游細胞信號通路與多種AD的病理機制密切相關〔2〕，而以miRNA為靶點的反義miRNA在AD治療中前景廣闊〔3〕。本文對miRNA在AD中的作用機制進行綜述。

1 miRNA的產生及作用機制

miRNA是一種內源性的非編碼RNA(ncRNA)，在中樞神經系統中廣泛分布，對神經發育、分化、成熟發揮重要的調節作用。在細胞核內，編碼miRNA的基因首先在RNA聚合酶(Pol)Ⅱ的作用下被轉錄成前體轉錄體Pri-miRNA，然后被Drosha酶等加工成前體Pre-miRNA〔4〕。輸出蛋白(Exportin)-5將Pre-miRNA運到細胞質，在Dicer酶的作用下形成雙鏈的miRNA配對分子。隨后雙鏈分解成單鏈，一條為隨從鏈(passenger strand)，一條為導向鏈(guide strand)。單鏈進入核糖蛋白復合體miRNP(RISC)，并在其作用下形成成熟的miRNA。miRNA與靶向mRNA的3′UTR互補配對，抑制翻譯或者翻譯后水平表達。如果miRNA與mRNA高度互補配對，使mRNA裂解，若匹配度不高則抑制靶mRNA的翻譯〔5〕；導致相關蛋白質無法合成或者合成減少，從而調控基因的表達。哺乳動物基因更加復雜，所以大多是抑制基因表達而非降解。此外，還發現少數miRNA可與5′UTR互補配對裂解靶mRNA或抑制其翻譯〔6，7〕。

2 miRNA在AD中的作用機制

AD的發病機制尚不十分明確，目前被廣泛認可的主流是Aβ學說和Tau蛋白學說，此外，AD還與神經發生、細胞凋亡、細胞周期再入及炎癥反應有關。這些作用機制與miRNA的調控密不可分。

2.1miRNA與神經發生 成年神經發生是指成年大腦中神經干細胞(NSC)通過增殖產生新生神經元并遷移至功能區，不斷分化成熟，并整合到神經環路中形成具有功能活性神經元的過程，主要包括神經元增殖、遷移、分化、成熟、存活等過程。其中，海馬齒狀回顆粒下區(SGZ)和側腦室室下區(SVZ)的神經發生對維持正常學習記憶至關重要。但在AD中，SGZ和SVZ的神經發生均有一定程度的損害〔8〕，而運動可通過促進成年海馬神經發生改善AD小鼠認知功能，提示神經發生的損害在AD的發生發展中起關鍵作用。

研究已證實，神經發生的不同階段存在大量miRNA的差異性表達，它們與轉錄因子及染色質修飾物之間構成復雜的調節網絡，在神經發生的不同階段發揮不同的作用。甲基化結合蛋白(MBD)1是一種甲基化CpG結合域蛋白，參與調控細胞生長發育。研究發現，MBD1能調節成年神經發生，miR-184過表達會使MBD1缺失從而提高NSC增殖，降低NSC分化〔9，10〕；而抑制miR-184表達可緩解MBD1 缺失引起的NSC過度分化〔10〕。進一步研究發現，MBD1與miR-184間的調控是相互的，MBD1可通過調控miR-184與膜相關蛋白Numb1 mRNA的3′UTR結合抑制其翻譯，從而調控神經干細胞分化〔9〕；而增加Numb1表達可緩解過表達miR-184誘導的神經元損傷。提示miR-184作為MBD1、miR-184與Numb1調節網絡的中心環節，可調控NSC增殖分化間的動態平衡。miR-124特異性表達于成年神經細胞中，在成年SVZ NSC分化中起了關鍵作用。敲除miR-124可維持SVZ NSC處于正在分裂的神經前體細胞階段，而過度表達miR-124會誘發神經元早熟，提示miR-124可調控NSC在過度擴增細胞和神經母細胞之間轉化。轉錄因子性別決定基因盒(Sox)-9通過Notch信號通路調控神經祖細胞向膠質細胞分化，而miR-124可通過抑制Sox9表達，誘導NSC向神經元分化〔11〕。因此，miR-124誘導的Sox9表達對SVZ NSCs向神經元譜系分化至關重要。miR-137在成體神經細胞中特異性表達，參與神經元成熟過程。過表達miR-137抑制大腦和初級神經元的樹突形態及其表型成熟，而抑制miR-137結果則相反〔12〕。進一步研究表明，miR-137通過抑制Ech2(一種組蛋白甲基轉移酶和PcG蛋白)翻譯，減少成年SGZ NSC中H3K27me3水平〔13〕。此外，miR-137受到甲基CPG結合蛋白(MeCP)2和Sox2的表觀遺傳調控〔14〕。提示miR-137、MeCP和PcG可能形成了一個交互閉環，在特定的基因域調控H3K27me2水平，從而影響基因表達。與miR-137相反，miR-132通過抑制核受體相關蛋白1〔15〕和抑制因子元件-1〔16〕的轉錄后表達，促進樹突發生、突觸整合和新生神經元存活〔17〕。

2.2miRNA與神經細胞凋亡 細胞凋亡是AD中神經元的死亡形式，細胞凋亡的發生可被抗凋亡因子(Bcl-2、Bcl-w和Mcl-1)和促凋亡因子(Bax、Bak-1和Puma)調控。miRNA可調節抗凋亡因子。在AD轉基因小鼠腦內，Bcl-2表達下調，同時伴隨miR-34a的高表達〔18〕，進一步研究證實miR-34a可負調控Bcl-2表達，誘導細胞凋亡，加劇神經元丟失〔19〕。除miR-34a之外，miR-15b、miR-29a、miR-181a/c和miR-210也對Bcl-2起調節作用。在AD中，miR-125b和miR-422上調，Bcl-w表達下降，細胞凋亡增加〔20〕。此外，miR-153和miR-181a/c可靶向作用于另一種抗凋亡因子Mcl-1〔21〕，抑制細胞凋亡；而下調miR-512，可誘導Mcl-1分泌增加，從而改善AD〔22〕。miRNA調節促凋亡因子。研究發現，在神經元或星形膠質細胞中，miR-29a/b、miR-125b可抑制Puma和Bak-1，抑制細胞凋亡〔23〕。上調miR-23a和miR-27a會通過抑制Bax和Puma起神經保護作用，而下調會造成急性缺血條件下的腦損傷〔24〕。

2.3miRNA與細胞周期再入 正常情況下，成年神經元平時處于休眠狀態，而在DNA受損超過其修復能力時，細胞周期蛋白(cyclin)異常表達，驅使細胞周期異常啟動，這些被迫重新啟動的神經元進入細胞周期后并不能繼續分化，而是走向死亡。研究發現，在AD腦內，p53表達增加，促使細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4磷酸化，磷酸化的CDK4可磷酸化視網膜母細胞瘤(Rb)蛋白，使其與E2F1蛋白解離，后者驅動細胞周期再入。AD中受損神經元重新進入細胞周期(細胞周期再入)已成為AD早期主要病例特征之一〔25〕。

目前，與AD腦內細胞周期再入相關的miRNA包括miR-26b、miR-34a、miR-106b等。其中，miR-26b可促進編碼RbmRNA的翻譯〔26〕，驅使AD腦內細胞周期再入；而抑制miR-26b可抑制細胞周期再入，緩解AD神經元受損。miR-34a可通過抑制Cyclin D1進而抑制淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素(PS)-1小鼠腦內的細胞周期再入〔27〕。此外，有研究發現AD腦內miR-106b表達增加，神經元重新進入細胞周期〔28〕，提示抑制miR-106也可抑制細胞周期再入，但目前并不清楚miR-106作用的目標蛋白。

2.4miRNA與神經炎癥反應 神經炎癥在AD病理生理學中有重要作用，有證據表明，來自外周的星形膠質細胞、小膠質細胞(MG)和免疫細胞參與AD中神經炎癥和神經變性的過程。其中，MG是中樞神經系統免疫的主要組成部分，當它處于靜止狀態時有助于神經保護。研究證實，miRNA介導的神經炎癥反應可能與AD發病機制有關。miR-146a是一種高度誘導型miRNA，與炎癥機制有關。AD中miR-146a表達升高，高表達的miR-146a可促進核因子(NF)-κB介導的促炎因子白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的分泌〔29〕。此外，miR-9、miR-34a、miR-125b和miR-155，也通過NF-κB介導TNF-α、IL-1β及集落刺激因子(CSF)上調，誘導AD發生。提示部分miRNA可負調節NF-κB，介導神經炎性反應。另外，Toll樣受體(TLR)4作為NF-κB的上游通路，可被miR-181c 激活，從而減少NF-κB介導的炎癥〔30〕。此外，正常情況下miR-124可使MG維持在靜止狀態，AD中miR-124表達下調，促使轉錄因子C/EBP-α表達，激活M1型MG，抑制M2型MG，阻止損傷的神經進行修復，致使AD進程不斷加劇〔31〕。

2.5miRNA與Tau過度磷酸化 Tau蛋白是一種可溶性的蛋白質，由位于17號染色體上的MAPT基因編碼，在腦部神經元中表達豐富，有穩定神經元微管的作用。當Tau表達異常時就會引發神經系統疾病。Tau蛋白過度磷酸化由體內的蛋白激酶引起，根據作用位點可分為兩類，一類是作用于脯氨酸的激酶，如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、CDK5；另一類是非作用于脯氨酸的蛋白激酶，如促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。miRNA可通過調節激酶參與Tau蛋白的磷酸化過程。

CDK5在大腦正常發育中不可或缺，其與p35蛋白結合后被激活，促進tau蛋白過度磷酸化。miR-107可通過調節p35表達，間接上調CDK5水平，從而促進tau蛋白過度磷酸化。此外，miR-125b也可直接促使CDK5表達上調，促進tau蛋白過度磷酸化〔32，33〕。GSK-3β是一種色氨酸/蘇氨酸激酶，可過度磷酸化tau，降低其對微管的穩定作用。作為miR-26a的下游基因，miR-26a通過激活Wnt信號通路磷酸化GSK-3β，從而促進tau過磷酸化。與miR-26a功能相反，miR-153表達增加可下調GSK-3β水平，減少tau蛋白磷酸化〔34〕，減緩AD。細胞外信號調節激酶(ERK)是MAPK 3條信號通路之一。在AD中，miR-132可下調ERK信號通路，促使tau蛋白過度磷酸化〔35〕。此外，miR-124和miR-132也可通過調節Tau蛋白外顯子10的剪接過程，直接調控tau蛋白表達〔36〕。

2.6microRNA與Aβ沉積 Aβ是β-APP在β-分泌酶(主要是BACE1)、γ-分泌酶(主要是PS-1)連續作用下分解產生的多肽片段。正常情況下，Aβ生成和清除處于動態平衡狀態，而當Aβ生成和清除出現異常時，其緩慢沉積可形成老年斑，產生神經毒性效應。miRNA可通過調節Aβ生成和清除相關基因的表達，調控Aβ沉積。

2.6.1miRNA調節Aβ生成 miRNA可通過調控或負調控APP、BACE1、PS-1基因調節Aβ生成。miRNA可調節APP的合成、剪接和胞吞作用。miR-124表達下調會促進多聚嘧啶區結合蛋白(PTBP)1和PTBP2，而PTBP1控制前體APP的剪接，促進產生的APP異構體中含有外顯子7和8〔37〕；已有研究表明在AD患者腦中外顯子7和8隨著異構體的增加而增多〔38〕。miR-20a可與編碼APP的mRNA的3′UTR結合，導致前體APP產生受限，影響Aβ的產生；在人體Hela細胞和大鼠海馬神經元中，發現miR-101與miR-20a功能相同。miR-153下調會抑制同源旁系的淀粉樣肽前體蛋白(APLP)2基因，后者參與APP的功能表達，異常的APLP2加工會導致APP的錯誤定位〔39〕。在Aβ的生成過程中，膽固醇可促進APP和BACE1移位到脂筏，通過胞吞作用加速APP加工成Aβ，miR-181c、miR-137的下調與之相關〔40〕。此外，miR-17p、miR-106a、miR-137等也可通過調控APP蛋白表達，參與調控腦內Aβ沉積〔41〕。

研究發現，下調miR-106b導致了BACE1表達增多，驅動APP向Aβ水解途徑轉移，促進Aβ生成增多〔42〕。miR-124除了可調控APP之外，還可靶向負調控BACE1，抑制Aβ42的產生〔43〕。miR-107是一種在AD早期表達減少的miRNA，可負調控BACE1，調控Aβ沉積〔44〕。此外，miR-29分為miR-29a、miR-29b-1和miR-29c多個亞型，三者的過度表達均可降低內源性BACE1的水平，抑制Aβ的產生，減緩AD。PS-1是γ-分泌酶參與Aβ生成的重要催化劑之一，在PS-1敲除小鼠中，miR-9表達下調，提示miR-9可靶向于PS-1基因，調控Aβ沉積。在γ-分泌酶參與Aβ生成的過程中miR-138發揮了重要作用，它可以通過抑制RARα干擾ERK-1，調節γ-分泌酶水解C99片段，促進Aβ毒性肽的產生〔45〕。同時在APP/PS-1轉基因小鼠也發現了miR-9表達顯著下調，且發現miR-9的下調也與APP功能障礙有關〔46〕。提示miR-9可以靶向于APP和PS-1基因，調控APP和PS-1的表達。miRNA可以調控前體APP、APP、PS-1、BACE1等Aβ生成相關蛋白，然而這種調控并不是單一發揮作用的，它們之間相互聯系，多個或者同時被miRNA調控，從而影響Aβ的生成過程。

2.6.2miRNA調節Aβ清除 APP C-末端片段AICD可誘導神經元釋放金屬內肽酶(MMEP)、腦啡肽酶(NEP)、胰島素降解酶(IDE)，促進Aβ42降解。然而，目前尚不清楚miRNA如何調節Aβ降解酶。低密度脂蛋白相關受體(LRP)1和LRP2等可控制血腦屏障(BBB)的通透性從而控制Aβ42進入大腦循環〔47〕。靈長類動物實驗發現miR-603使LRP1表達上調，加速Aβ42的清除〔48〕。miR-146a可直接靶向LRP2，加速腦內Aβ42的清除〔49〕。在BBB的人內皮細胞模型中，miR-107表達下調，BBB的完整性被破壞。實際上，miR-107表達下調促進BBB通透性調節劑Endophilin-1表達，促使緊密連接蛋白再合成，抑制了BBB的完整性恢復，從而減慢清除速率〔50〕。此外，缺氧小鼠和人腦微血管內皮細胞實驗證實miR-132/212的過表達也會破壞BBB的完整性〔51〕。最近研究發現，在腦缺血再灌注的大鼠實驗中，miR-21通過MAPK信號通路，抑制了大鼠血腦屏障損傷〔52〕，但是否與Aβ清除有關還需進一步研究。此外，自噬-溶酶體途徑也可促進Aβ清除，miRNA可直接或間接調節自噬-溶酶體系統。Beclin-1是自噬過程的催化劑，增加miR-30a可抑制Beclin-1蛋白表達，破壞自噬-溶酶體途徑〔53〕。miR-106b、miR-124下調會通過抑制SIRT1下調Beclin-1，抑制自噬-溶酶體途徑對Aβ的清除〔54，55〕。TREM2作為AD的風險基因，可識別胞外的Aβ42，促進自噬清除Aβ42〔56〕。miR-34a可負向調控TREM2，抑制Aβ清除。AD中miRNA對Aβ42清除的調控涉及蛋白酶體降解清除、血腦屏障轉運清除和自噬清除等途徑。然而，目前的研究還存在很多難點，無論是miRNA對Aβ的生成還是清除的調節都有很多分子層面的機制沒有明晰。

綜上，miRNA的異常表達是AD的特征之一，前者在轉錄后水平調節相關基因表達參與了AD的發生發展。當前研究已知miRNA可以調控神經發生、細胞凋亡、細胞周期再入、神經炎癥、Tau蛋白病變及Aβ沉積。miRNA可通過Sox9、Numb1、MBD1等調節增殖分化間的平衡進而調控神經發生；可通過抑制抗凋亡因子、促進促凋亡因子促進AD中的細胞凋亡；可通過促進GSK-3β、CDK5、MAPK表達上調導致Tau過磷酸化；可通過上調APP、BACE1等促進Aβ沉積，促進LRP1、2和Beclin-1表達加速Aβ清除；還可通過下調促炎因子和上調抗炎因子來抑制炎癥反應起神經保護作用。另外，miRNA可與各種信號通路相互作用，形成復雜的調解網絡共同影響AD的發生、發展。目前為止miRNA對AD的作用機制尚不十分明確，但其為治療AD提供了靶點。