重癥肌無力患者外周血PD-1和IL-23水平及其與AChR-Ab、病情嚴重程度相關性

袁慧姣，韓 波

重癥肌無力是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，特征是血中出現針對神經肌接頭不同成分的抗體，85%的重癥肌無力患者存在乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibodies,AChR-Ab)，以肌無力為主要臨床表現，具有晨輕暮重、休息或使用膽堿酯酶抑制劑后減輕的特點[1-2]。雖然目前臨床對重癥肌無力的研究已相當深入，能夠根據不同自身抗體對其進行分型，但其具體病理生理機制仍未完全闡明[3]。近年有研究報道白細胞介素-23(interleukin-23， IL-23)是輔助性T淋巴細胞17(Th17)的重要刺激分子，而后者在重癥肌無力的發病中發揮關鍵作用[4]。與此同時，越來越多的學者指出程序性死亡受體-1(programmed death receptor-1， PD-1)會引發重癥肌無力癥狀[5]。提示PD-1及 IL-23可能參與了重癥肌無力的發病機制。因此，本研究探討重癥肌無力患者外周血中PD-1和IL-23的水平及其與AChR-Ab、病情嚴重程度相關性，以期為其在重癥肌無力病理生理機制中發揮的作用提供線索。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年12月—2019年12月在遼寧中醫藥大學附屬醫院就診的符合納入及排除標準的重癥肌無力44例作為重癥肌無力組，其中男21例，女23例；年齡31～55(44.2±12.5)歲。另選取同期在該院進行體檢的健康體檢者44例作為健康體檢組，其中男20例，女24例；年齡28～52(41.6±11.4)歲。兩組性別及年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準同意執行。

1.2納入及排除標準 納入標準：①年齡>18歲；②符合重癥肌無力診斷治療標準，表現為典型重癥肌無力癥狀，新斯的明試驗陽性且低頻重復神經電刺激波幅遞減10%以上[6]；③未接受膽堿酯酶抑制劑或免疫抑制劑治療；④患者和(或)其家屬簽署相關知情同意書。排除標準：①其他原因引起的眼肌麻痹患者；②Guillain-Barra綜合征患者；③慢性獲得性脫髓鞘性多發性神經病患者；④多發性肌炎患者；⑤Lambert-Eaton綜合征患者；⑥代謝性疾病如甲狀腺功能亢進癥、甲狀腺功能減退癥和糖尿病等引起的眼肌麻痹或外周神經病變患者；⑦惡性腫瘤患者；⑧嚴重臟器功能不全患者；⑨其他自身免疫性疾病患者；⑩懷孕或哺乳期婦女。

1.3材料及方法

1.3.1血樣采集：所有入選者均于晨起空腹時采集靜脈血2份至含有乙二胺四乙酸的真空管中，其中1份(4 ml)于4℃靜置并3000 r/ min 離心10 min,取上清液存于-80℃冰箱凍存備用；另1份(6 ml)用于外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMCs)的分離。

1.3.2流式細胞術檢測PBMCs中PD-1水平：在血樣中按1∶1的體積比加入磷酸鹽緩沖鹽(PBS) 稀釋混勻，加入裝有6 ml淋巴細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)的離心管中2000 r/min 離心20 min，分離PBMCs層轉移至新離心管并加入 PBS 混勻，2000 r/min離心10 min，洗滌 2 次后重懸細胞，后加入抗人PD-1抗體(中國abcam公司生產)進行染色，洗滌細胞并加入4%多聚甲醛(上海生工生物科技有限公司生產)固定，隨后采用MACSQuantTM流式細胞儀(中國美天旎生物技術公司生產)檢測PD-1陽性細胞比例。

1.3.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清IL-23及AChR-Ab水平：采用人血清IL-23(美國Thermo Fisher Science公司生產)、AChR-Ab(南京森貝伽生物科技有限公司生產)ELISA檢測試劑盒及MultiskanTMFC酶標儀(美國Thermo Fisher Science公司生產)檢測血清IL-23及AChR-Ab水平，每個樣品重復3次試驗取其平均值。

1.3.4患者病情嚴重程度評估：采用重癥肌無力定量(quantitative myasthenia gravis， QMG)評分評估重癥肌無力組病情嚴重程度，QMG評分包括復視、上瞼下垂、面肌、吞咽功能、構音障礙、頸肌、雙側臂力、肺活量、雙側握力和雙側腿肌13個項目，涉及眼、延髓、呼吸、頸和四肢5個方面的評估，每個項目0～3分，由低到高代表功能依次減退，總分0～39分[7]。

2 結果

2.1重癥肌無力組和健康體檢組外周血PD-1與 IL-23比較 外周血中PD-1與IL-23，重癥肌無力組分別為(18.07±5.54)%和(29.51±4.81)pg/ml，高于健康體檢組(10.67±2.50)%和(20.44±5.15)pg/ml，差異有統計學意義(t=8.482，P<0.001;t=8.083,P<0.001)，見圖1。

2.2外周血PD-1和 IL-23對重癥肌無力的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示，外周血PD-1和IL-23診斷重癥肌無力的AUC分別為0.887(95%CI:0.816,0.959;P<0.001)和0.890(95%CI:0.825,0.955;P<0.001),見圖2。外周血PD-1和IL-23診斷重癥肌無力的最佳截斷值分別為15.07%和24.44 pg/ml；在最佳截斷值下，外周血PD-1診斷重癥肌無力的特異度、敏感度、準確率和一致率分別為95.5%、72.7%、68.2%、84.1%，外周血IL-23診斷重癥肌無力的特異度、敏感度、準確率和一致率分別為79.6%、84.1%、64.6%、81.8%。

2.3重癥肌無力患者外周血PD-1和 IL-23與AChR-Ab的相關性分析 重癥肌無力44例AChR-Ab為(1.29±0.33)nmol/L。Pearson相關性分析結果顯示，重癥肌無力患者外周血PD-1和 IL-23與AChR-Ab均呈正相關，r分別為0.735(P<0.001)和0.725(P<0.001),見圖3。

2.4重癥肌無力患者外周血PD-1和 IL-23與QMG評分的相關性分析 重癥肌無力44例QMG評分為(5.35±1.48)分。Pearson相關性分析結果顯示，重癥肌無力患者外周血PD-1和 IL-23與QMG評分均呈正相關，r分別為0.695(P<0.001)和0.693(P<0.001)。見圖4。

3 討論

重癥肌無力是影響神經肌肉接頭的主要疾病，年發病率為(8～10)/100萬，患病率為(150～250)/100萬，發病機制涉及細胞免疫和補體，且有多種自身抗體參與[8-12]。既往研究報道多種分子參與重癥肌無力的發生和發展，并且根據不同自身抗體表達可將其分為不同亞型[13]。但由于重癥肌無力發病機制現仍未完全闡明，部分患者治療效果欠佳或易復發，進一步探討其相關細胞因子及表面抗體有助于開發新的診斷治療靶點。

本研究結果顯示，外周血中PD-1與IL-23，重癥肌無力組分別為(18.07±5.54)%和(29.51±4.81)pg/ml，高于健康體檢組(10.67±2.50)%和(20.44±5.15)pg/ml，差異有統計學意義。IL-23是Th17分泌的重要細胞因子，可通過維甲酸受體相關孤兒受體激活IL-17信號通路，并且可通過Jak2/tyk2-STAT3和核因子(NF)-κB 信號通路產生其他促炎性細胞因子和趨化因子[14]?，F臨床針對IL-23的單抗已被用于多種自身免疫性疾病如銀屑病、類風濕性關節炎和炎癥性腸病等的治療[15]。PD-1是一種抑制性受體，屬于CD28/CTLA-4家族，通過結合程序性死亡配體(PD-L)1和PD-L2提供抑制信號維持T細胞激活、耐受和免疫介導組織損傷之間的平衡[16]。目前，越來越多的研究表明PD-1和PD-L1通路在自身免疫性疾病如自身免疫性肝炎和系統性紅斑狼瘡中發揮重要的作用[17-18]，但是關于PD-1及 IL-23在重癥肌無力患者外周血中水平的研究卻十分有限。

本研究明確了PD-1和 IL-23在重癥肌無力患者外周血中升高后，進一步探討外周血PD-1和 IL-23對重癥肌無力的診斷價值，結果顯示外周血PD-1和IL-23診斷重癥肌無力的AUC分別為0.887和0.890,均接近0.9，具有較好的診斷價值;最佳截斷值分別為15.07%和24.44 pg/ml。王彩琴等[19]的研究結果顯示，重癥肌無力患者外周血淋巴細胞PD-1陽性率為20%，高于健康對照者，本研究結果與其結論基本相符。本研究結果顯示，外周血PD-1和IL-23最佳截斷值下診斷重癥肌無力的特異度、敏感度、準確率和一致率分別為95.5%、72.7%、68.2%、84.1%和79.6%、84.1%、64.6%、81.8%。說明外周血 PD-1診斷重癥肌無力的準確率及一致率均高于IL-23，可見其整體診斷價值高于IL-23，且其診斷特異度高達95.5%；而IL-23診斷重癥肌無力的敏感度高于PD-1。提示IL-23適用于對可疑重癥肌無力人群的初步篩查，而PD-1則適用于對重癥肌無力患者的確診。

AChR-Ab在重癥肌無力患者中有85%的陽性率，是重癥肌無力發病的重要介質，也是診斷重癥肌無力的重要參考指標[6]。因此，本研究進一步探討了重癥肌無力患者外周血PD-1和 IL-23與AChR-Ab的相關性，結果顯示重癥肌無力患者外周血PD-1和 IL-23與AChR-Ab均呈正相關，r分別為0.735和0.725，均在0.7以上，說明外周血PD-1和 IL-2與重癥肌無力主要致病抗體AChR-Ab有較好符合度。最后，本研究為探討外周血IL-23和PD-1與重癥肌無力病情嚴重程度之間的相關性，采用QMG評分對患者病情嚴重程度進行了量化，分析外周血PD-1和IL-23與QMG評分的相關性,結果顯示重癥肌無力患者外周血PD-1和 IL-23與QMG評分呈正相關，r分別為0.695和0.693。QMG評分由美國重癥肌無力協會提出后被廣泛用于重癥肌無力患者的病情評估及治療方法效果評估，具有較好預后預測價值[20-21]。本研究結果說明外周血IL-23和PD-1與QMG評分具有中度相關性，對重癥肌無力患者病情嚴重程度及治療效果判斷具有一定價值。

本研究也存在一定不足之處，首先，由于受醫院醫療規模所限，樣本量稍顯不足，后續研究將以本研究作為參考計算樣本量并予以擴充，必要時增設多中心研究以進一步驗證結論；其次，本研究采用流式細胞術及ELISA作為血液指標的檢測方法，后續研究可采用其他方法如放射免疫法和免疫印跡試驗等對指標進行多種技術的相互驗證以提高檢測的準確性；最后，本研究只納入了AChR-Ab作為驗證外周血PD-1和 IL-23的自身抗體指標，后續可納入其他抗體如MuSK抗體和LRP4抗體等驗證外周血PD-1和 IL-23對其他重癥肌無力亞型的診斷價值。

綜上所述，重癥肌無力患者外周血IL-23和PD-1高于健康體檢者；外周血IL-23和PD-1對重癥肌無力有較好的診斷價值，且其與AChR-Ab、病情嚴重程度呈正相關。