柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠體內(nèi)消化指標(biāo)的影響

戴圻霏，韓建華，孫旸*，陳光

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；2.吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林 吉林 132012）

柞蠶絲素蛋白是由柞蠶絲腺內(nèi)壁上的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的高純度蛋白質(zhì)，包含丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸等14種氨基酸。柞蠶屬于野蠶，主要分布在遼寧、河南等地。目前，我國柞蠶原料繭和蠶絲產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的3/4。長期以來，柞蠶絲最為主要價(jià)值在于紡織，但是隨著時(shí)代的不斷發(fā)展，許多科學(xué)家對(duì)其不斷開發(fā)，范圍覆蓋了多個(gè)領(lǐng)域，比如手術(shù)后的縫合線、涂料、分離膜及生物活性物的固定化和智能型水凝膠等，目前柞蠶絲有很大的發(fā)展空間。

絲素蛋白主要應(yīng)用于兩大領(lǐng)域，生物材料和生物醫(yī)學(xué)。但是近幾年來，研究人員對(duì)絲素蛋白在食品方面的應(yīng)用也有所探究。如韓建華等[1-2]稱取柞蠶絲素納米粉產(chǎn)品12 g加水至40 mL混勻，按40 mL/kg給予小鼠灌胃，觀察14 d結(jié)果顯示，柞蠶絲解酒保肝產(chǎn)品未對(duì)小鼠產(chǎn)生急性毒性反應(yīng)，以期證明柞蠶絲食品有一定的安全性。

本試驗(yàn)在大鼠生長試驗(yàn)的基礎(chǔ)上開展試驗(yàn)，通過測(cè)定大鼠對(duì)柞蠶絲素蛋白的消化吸收狀況，以及通過喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和氮代謝實(shí)驗(yàn)，來檢測(cè)柞蠶絲素蛋白營養(yǎng)價(jià)值及食用安全性，對(duì)柞蠶絲素蛋白的營養(yǎng)價(jià)值作進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠：億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，試驗(yàn)用鼠均SPF級(jí)別，動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度為（20±2）℃，通風(fēng)頻率≥10次/h，生長環(huán)境均為12 h光照、12 h黑暗，作息規(guī)律。

1.2 飼料配方

參考美國官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）中蛋白質(zhì)功效比值（protein efficiency ratio，PER）測(cè)定方法中的飼料配方要求設(shè)計(jì)蛋白喂養(yǎng)飼料，以含酪蛋白的飼料為陽性對(duì)照，飼料配方如表1所示。

表1 柞蠶絲素蛋白試驗(yàn)飼料配方Table 1 Formula of tussah silk fibroin experiment feed%

1.3 儀器與試劑

SPD80全自動(dòng)定氮儀：優(yōu)品培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)器材有限公司；D2大鼠代謝籠：馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司；TU-1810型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；BS-600L電子天平：江蘇南京俱全儀器有限公司。

酪蛋白（含氮量13%）：天津大茂化學(xué)試劑廠；無氮飼料：天津天垚有限公司；正常組飼料：長春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物選擇與準(zhǔn)備

清潔級(jí)SD大鼠（SPF級(jí)，雄性，體重為90 g～110 g，日齡28 d）：億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)溫度為21℃～23℃，室內(nèi)相對(duì)濕度（relative humidity，RH）為70%～75%，自然光照，自由采食和飲水。每日給予大鼠足夠的特定飼料，大鼠飲水來自純凈的自來水[3]。

1.4.2 大鼠28 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為高蛋白組、低蛋白組、酪蛋白組、無蛋白組、正常組（空白對(duì)照），每組5只，組內(nèi)體重差不大于10 g。實(shí)驗(yàn)期間分別喂不同配方飼料，并進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)和觀察。

1.4.3 柞蠶絲素蛋白氨基酸測(cè)定

由吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院進(jìn)行測(cè)定待測(cè)柞蠶絲素中的各種氨基酸所占比例。

1.4.4 氮代謝實(shí)驗(yàn)

喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的第6天起進(jìn)行5 d的氮代謝實(shí)驗(yàn)。氮代謝實(shí)驗(yàn)的第1天及代謝期結(jié)束的次日早上在柞蠶絲素蛋白飼料中加入胭脂紅作為標(biāo)記，每只鼠首次排出紅色糞便為開始收集的信號(hào)，將大鼠的糞便全部收集到塑封袋中進(jìn)行凍干放置-20℃保存。每天將代謝籠漏斗下每只鼠的尿液收集于玻璃瓶中，置-20℃冰箱保存。糞便用凱氏定氮法定氮，尿液用考馬斯亮藍(lán)法定氮[4]。大鼠消化中食物氮是柞蠶絲素蛋白飼料中含氮量；糞氮是大鼠吃過飼料后排泄物的含氮量；糞代謝氮是大鼠食用無氮飼料后排泄物中的含氮量；糞內(nèi)源氮指無氮（蛋白質(zhì)）膳食條件下，機(jī)體由糞便排出的氮；尿內(nèi)源氮指無氮（蛋白質(zhì)）膳食條件下，機(jī)體由尿排出的氮。

1.4.5 柞蠶絲素蛋白消化實(shí)驗(yàn)

待大鼠生長穩(wěn)定，開始進(jìn)行消化實(shí)驗(yàn)測(cè)定柞蠶絲素蛋白在大鼠體內(nèi)的消化、吸收、代謝等數(shù)值。飼養(yǎng)一段時(shí)間后，每天稱量食物消耗，收集每天未消化的飼料、排泄物和尿液，并且小心分離，將排泄物在100℃真空干燥箱過夜研磨，排泄物根據(jù)氮代謝實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)值進(jìn)行計(jì)算相關(guān)消化指標(biāo)。

1）蛋白質(zhì)功效比值（protein efficiency ratio，PER）是大鼠體重的增加與所攝取的蛋白質(zhì)之比，表示將蛋白質(zhì)用于生長的效率。

PER=實(shí)驗(yàn)期內(nèi)動(dòng)物體重增加克數(shù)/實(shí)驗(yàn)期內(nèi)攝入的蛋白質(zhì)克數(shù)

2）蛋白質(zhì)消化率反映蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)被分解程度，同時(shí)還反映消化后的氨基酸和肽被機(jī)體吸收的程度。其中，消化率分為真消化率（true digestibility，TD）和表觀消化率（apparent digestibility，AD）。

TD/%=[食物氮-（糞氮-糞代謝氮）]÷食物氮×100

AD/%=（食物氮-糞氮）÷食物氮×100

3）生物價(jià)（biological value，BV）是機(jī)體的氮儲(chǔ)留量與氮吸收量之比。尿內(nèi)源氮是機(jī)體在無氮膳食條件下尿中所含有的氮，它們來自體內(nèi)組織蛋白質(zhì)的分解。主要用來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的價(jià)值，它表示食物中的蛋白質(zhì)成分在體內(nèi)真正被利用的程度。

BV=儲(chǔ)留氮÷吸收氮

儲(chǔ)留氮=吸收氮-（尿氮-尿內(nèi)源氮）

吸收氮=攝入氮-（糞氮-糞內(nèi)源氮）

攝入氮=糞氮十尿氮

4）蛋白質(zhì)凈利用率（net protein utilization，NPU）是機(jī)體的氮儲(chǔ)留量與攝入氮量之比，表示蛋白質(zhì)實(shí)際被利用的程度。

NPU/%=儲(chǔ)留氮÷食物氮=生物價(jià)×表觀消化率

測(cè)定相關(guān)消化指標(biāo)后，進(jìn)行進(jìn)一步柞蠶絲素蛋白安全性能檢查。

1.4.6 大鼠血液生化指標(biāo)測(cè)定

大鼠喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，給予麻醉藥15 min，從大鼠肛門處向胸腔剪開，在腸胃后部的脊柱動(dòng)脈扎入抽血針，進(jìn)行抽血[5-6]。每組各鼠取0.5 mL大鼠血液送到吉林市龍?zhí)秴^(qū)鐵東醫(yī)院測(cè)其血液中各項(xiàng)生化指標(biāo)。

1.4.7 柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠組織病理學(xué)的影響

抽血后處死各組大鼠，仰位固定于板上，剖腹取出心、肝、脾、肺、腎和睪丸，先肉眼觀察高蛋白組合低蛋白組大鼠的各個(gè)器官與正常組之間的差異，外形、體積、顏色、質(zhì)地有無改變。然后進(jìn)行器官取樣放入0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphat buffer saline，PBS）配制的4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中固定送到吉林醫(yī)藥學(xué)院病理教研室進(jìn)行切片觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 柞蠶絲素蛋白氨基酸組成

柞蠶絲素蛋白氨基酸組成見表2。該蛋白中丙氨酸（Ala）含量最高，占氨基酸總量的45.952 5%，蛋氨酸（Met）含量最少僅含0.0648 7%。

表2 柞蠶絲素蛋白各種氨基酸含量Table 2 Amino acid content of tussah silk fibroin

柞蠶絲素蛋白是由柞蠶絲腺內(nèi)壁上的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的高純度蛋白質(zhì)摻雜著少量雜質(zhì)，經(jīng)過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)包含丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸等14種氨基酸。柞蠶絲素蛋白含有5種人體必需氨基酸：苯丙氨酸（phenylalanine）、蛋氨酸（methionine）、異亮氨酸（isoleucine）、亮氨酸（leucine）、纈氨酸（valine）。其中甘氨酸和絲氨酸具有降低血液中膽固醇濃度；丙氨酸有促進(jìn)酒精代謝的作用；酪氨酸具有預(yù)防老年癡呆的作用[9]。所以，柞蠶絲素蛋白在食用方面有很高的營養(yǎng)價(jià)值。

2.2 柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠體內(nèi)機(jī)能影響

2.2.1 柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠體重的影響

柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠體重的影響見表3。

如表3所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，28 d喂養(yǎng)后，大鼠的體重、攝食量在高、低蛋白組和正常組間比較存在顯著性差異，即攝入柞蠶絲素蛋白可以降低大鼠體內(nèi)脂肪，減少食物攝取，可能發(fā)揮減肥作用。

表3 柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠體重的影響Table 3 Effect of tussah silk fibroin on rat weight

2.2.2 柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠消化指標(biāo)的影響

柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠消化指標(biāo)的影響如表4所示。

表4 柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠消化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of tussah silk fibroin on digestive indexes of rats

如表4所示，28 d喂養(yǎng)后，使用凱氏定氮儀測(cè)得儲(chǔ)留氮和吸收氮數(shù)值，與正常組比較，高蛋白組和低蛋白組的PER顯著性降低（P<0.05）。PER計(jì)算得到負(fù)值，與正常組相比存在差異原因在于大鼠在28 d的柞蠶絲素蛋白飼料飼養(yǎng)過程中，體重不斷減輕。高蛋白組和低蛋白組的生物價(jià)與比正常組相比略低，分別達(dá)到了（98.13±1.74）和（96.35±2.66），蛋白質(zhì)被機(jī)體利用程度越高，食物被消化后產(chǎn)生的含氮廢物就越少，有利于減輕肝、腎的負(fù)擔(dān)[10-12]，所以正常組的飼料對(duì)大鼠吸收消化略優(yōu)于柞蠶絲素蛋白飼料。

2.2.3 柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠生化指標(biāo)的影響

柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響見表5。

如表5所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，28 d喂養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)低蛋白組與高蛋白組總蛋白、血白蛋白、球蛋白、總膽紅素、乳酸脫氫酶、甘油三酯較正常組均有顯著性改變；低蛋白組高密度脂蛋白、低密度脂蛋白也有顯著性改變，其余的生化指標(biāo)與正常組比較，均未見顯著性改變（P>0.05）。其中，低、高蛋白組總蛋白、血白蛋白、高密度脂蛋白、總膽紅素、乳酸脫氫酶、球蛋白均在正常范圍內(nèi)，高蛋白組白球比略低于正常值（1.08 g/L～1.31 g/L）。

表5 柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of tussah silk fibroin on rat serum biochemical indicators

低蛋白組和高蛋白組甘油三酯低于正常范圍（0.67 mmol/L～1.85 mmol/L），且與正常組存在顯著性差異。究其原因發(fā)現(xiàn)甘油三酯與大鼠體重有關(guān)，說明柞蠶絲素蛋白對(duì)甘油三酯影響較大。從而發(fā)現(xiàn)蠶絲蛋白具有減肥效果，但是過高劑量柞蠶絲素蛋白對(duì)體內(nèi)生化指標(biāo)有影響，進(jìn)而產(chǎn)生副作用，所以考慮食用劑量應(yīng)該低于低劑量[13]。

2.2.4 柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠組織病理學(xué)的影響

高蛋白組與低蛋白組的大鼠與正常組比較，低蛋白組均和正常組無明顯差別，且無病變。但是高劑量柞蠶絲素蛋白組的大鼠肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)水腫的現(xiàn)象，如圖1所示。

圖1 高劑量柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠組織病理學(xué)的影響Fig.1 Effect of high-dose tussah silk fibroin on histopathology of rats

其他肺、腎、脾、心、睪丸均未見顯著性改變，即低劑量的柞蠶絲素蛋白對(duì)大鼠體內(nèi)各個(gè)器官無明顯影響，但是高濃度的高柞蠶絲素蛋白飼料喂養(yǎng)可能存在肝損傷風(fēng)險(xiǎn)，食用需適量。

3 結(jié)論

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，柞蠶絲素蛋白在作為飼料喂養(yǎng)大鼠，大鼠消化柞蠶絲素蛋白后，主要顯著特征是體重有所減輕，高蛋白組真消化率和表觀消化率分別為（54.65±4.00）%和（35.83±2.60）%，生物價(jià)為 98.13±1.74，蛋白質(zhì)凈利用率為56.67±2.93，功效比值為-0.99±0.43，低蛋白組TD 和AD 分別為（57.77±5.08）%和（33.36±1.19）%，BV 為 96.35±2.66，NPU 為（60.40±5.65）%，PER 為-0.99±0.43。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，柞蠶絲素蛋白在大鼠體內(nèi)吸收率較低，但是吸收入血后生物價(jià)基本大于95，說明機(jī)體對(duì)該蛋白利用率較高，但是PER為負(fù)值意味著大鼠體重有所減輕，由此判定柞蠶絲素蛋白維持大鼠體內(nèi)氮平衡時(shí)，可保存相應(yīng)肌肉和能量，減少部分多余脂肪量。根據(jù)生化指標(biāo)測(cè)定和大鼠組織病理學(xué)探究發(fā)現(xiàn)柞蠶絲素蛋白在飼料中比重過大對(duì)肝有一定影響，所以柞蠶絲素蛋白在減肥食用方面大有潛力但不宜大量食用，影響身體健康。