橄欖葉中多酚含量的測定及其抗輻射作用研究

孫美君，孔杭如，趙珈瑩，張伊瑾，林麗穎，郭東北，李蕾*

（1.廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102；2.中糧營養(yǎng)健康研究院，北京 102200）

輻射可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），破壞生物大分子，抑制抗氧化酶活性，增加脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡、壞死[1]，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)急、慢性損傷。橄欖葉是橄欖的副產(chǎn)品之一，含有橄欖苦苷、類黃酮等多酚類生物活性物質(zhì)[2-4]，具有抗氧化[5-6]、抗腫瘤[7]、降血糖、降血脂[8]、消炎鎮(zhèn)痛[9]等生物學(xué)功效，但其輻射防護(hù)作用未見報道。本研究采用超聲輔助水提工藝[10]制備橄欖葉提取物（olive leaf extracts，OLE），并測定其多酚含量。將不同劑量的OLE灌胃給予小鼠后，采用X射線輻照小鼠，參考我國《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》中對輻射危害有輔助保護(hù)功能的評價方法，研究OLE抗輻射作用，初步探討其作用機(jī)制，為橄欖葉的開發(fā)、利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖葉：廈門凝賦生物科技有限公司；福林酚（批號J43737）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號149917）：上海金穗生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（批號 20191226）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號 20191225）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒（批號20191225）：南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅染色液（批號C0105S）、裂解液（批號P0013B）：碧云天生物技術(shù)公司；Bax抗體（批號AF0120）、Bcl-2抗體（批號 AF6139）：Affinity Bioscience公司；GAPDH 抗體（批號 AB0037）：Abways公司；羊抗兔二抗（批號GAR001）：杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

實(shí)驗(yàn)動物：BALB/c雄性小鼠（清潔級），購自廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號[SCXK（滬）2017-0005]，體重18 g～22 g，飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，溫度（25±2）℃，濕度 50%～60%，12 h晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食飲水。

1.2 儀器

X射線生物學(xué)輻照儀（RS2000型）：美國Rad Source公司；全自動三分群血液細(xì)胞分析儀（BC-1800型）：深圳邁瑞公司；紫外分光光度計（T6型）：北京普析通儀器有限責(zé)任公司；石蠟切片機(jī)（RM2235型）、自動脫水機(jī)（TP1020型）、石蠟包埋機(jī)（EG1150型）、徠卡正置顯微鏡（DM4B型）：德國Leica公司；電泳儀（165-8033型）：美國Bio-Rad公司；超聲儀（SK8200H型）：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；凍干機(jī)（LABCONCO-18型）：美國Labconco公司。

1.3 橄欖葉多酚含量的測定

1.3.1 橄欖葉提取物制備

參照文獻(xiàn)[10]，稱取10 g橄欖葉，加入200 mL水、0.125 g硼砂、0.2 g亞硫酸氫鈉，混勻。超聲輔助提取1 h，過濾，減壓濃縮至 60 mL，按照 1∶1 的體積比，加入無水乙醇，4℃放置過夜。取上清液過濾、濃縮、冷凍干燥后得到OLE干粉，4℃避光保存。

1.3.2 橄欖葉中多酚物質(zhì)含量測定

參考胡瑞云等[11]的方法，取20 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品加水溶解，定容至 100 mL，制備 0.001、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL的沒食子酸工作液。取1.5 mL工作液，加入1.5 mL福林酚、2 mL 10%碳酸鈉溶液，混勻，定容至25 mL。反應(yīng)1 h，空白樣調(diào)零，755 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取制備的OLE粉末，乙醇溶解，定容至100 mL。量取0.5 mL，按沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品測定方法操作，上機(jī)測定并記錄吸光度值（OD）。

1.4 動物實(shí)驗(yàn)

1.4.1 樣品配制

根據(jù)前期的研究結(jié)果，分別設(shè)置150、500、1 000 mg/kg 3個OLE劑量[12]。根據(jù)每組小鼠的平均體重，稱取適量OLE，加水溶解，超聲充分混勻，配制不同濃度的OLE水溶液。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將小鼠隨機(jī)分為正常對照組，輻射對照組，低、中、高劑量OLE組，每組6只。低、中、高劑量OLE組分別灌胃給予150、500、1 000 mg/kg OLE，灌胃量0.3 mL。正常對照組與輻射對照組給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)30 d。第31天，除正常對照組外，其余4組小鼠均接受一次性X射線全身均勻輻射，輻射劑量為1 Gy（劑量率為5 cGy/s，持續(xù)20 s）[13]。照射后 6 h～12 h內(nèi)，眼球取血，分離血清，處死小鼠，取雙側(cè)股骨，剝離肝臟，液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 外周血細(xì)胞計數(shù)

采用全自動血液細(xì)胞分析儀檢測外周血紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、血小板（platelet，PLT）的數(shù)量。

1.5.2 血清氧化損傷指標(biāo)測定

按照試劑盒步驟，采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定血清SOD活力；采用酶促反應(yīng)測定血清GSH-Px活性；采用硫代巴比妥酸法測定血清MDA水平。

1.5.3 骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)

取小鼠雙側(cè)股骨，骨髓涂片，干燥后甲醇固定10min，取出晾干。蘇木素-伊紅染色液染色10 min～15 min，磷酸鹽緩沖液沖洗，晾干，油鏡觀察、計數(shù)含微核的嗜多染紅細(xì)胞。

1.5.4 Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)水平測定

1.5.4.1 總蛋白濃度測定

將肝臟組織剪碎，每100 mg肝組織加入1 mL裂解液（含1%苯甲基磺酰氟），研磨提取蛋白。將提取的樣品轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4℃離心取上清，-20℃分裝保存。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度試劑盒測定肝臟總蛋白含量。

1.5.4.2 Western Blot實(shí)驗(yàn)

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）法，按照蛋白樣品與上樣緩沖液體積比5∶1，加入上樣緩沖液煮沸至變性。上樣電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入Bcl-2與Bax抗體（按體積比1∶1 000稀釋），4℃振蕩孵育過夜。用吐溫20三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（tris buffered saline with tween 20，TBST）洗滌，加入羊抗兔二抗（按體積比1∶1 000稀釋），室溫（25℃～28℃）振蕩孵育2 h，TBST洗滌后曝光顯影。采用Image J軟件分析蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析、最小顯著性法進(jìn)行組間比較，以檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖葉中多酚的含量

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

如圖1所示，多酚（以沒食子酸計）標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=29.817X+0.019 5（R2=0.999 2），且在0.001 mg/mL～0.025 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。OLE的OD值為0.363±0.018，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，最終得出橄欖葉多酚含量為（57.55±2.98）mg/g。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 OLE對輻射小鼠外周血細(xì)胞的影響

各組小鼠外周血細(xì)胞數(shù)量見表1。

表1 OLE 對小鼠外周血細(xì)胞數(shù)量的影響（±s，n=6）Table 1 Effects of OLE on peripheral blood parameters in mice（±s，n=6）

表1 OLE 對小鼠外周血細(xì)胞數(shù)量的影響（±s，n=6）Table 1 Effects of OLE on peripheral blood parameters in mice（±s，n=6）

注：a表示與正常對照組比較，P<0.05差異顯著；b表示與輻射對照組比較，P<0.05差異顯著。

組別WBC/（×109個/L）RBC/（×1012個/L）PLT/（×109個/L）正常對照組 2.48±0.34 6.81±0.31 422.50±12.39輻射對照組 0.60±0.12a 4.13±0.10a 258.00±7.37a低劑量組（150 mg/kg） 1.17±0.36a 4.42±0.27a 295.50±7.15a中劑量組（500 mg/kg） 1.50±0.43ab 4.58±0.28a 330.33±10.16a高劑量組（1 000 mg/kg） 2.10±0.16b 5.43±0.29b 366.00±10.26ab

與正常對照組比，輻射對照組小鼠WBC、RBC和PLT數(shù)量均顯著下降（P<0.05）。與輻射對照組比較，中、高劑量OLE組小鼠WBC數(shù)量均顯著升高（P<0.05），高劑量組PLT、RBC數(shù)量顯著增加。

2.3 OLE對輻射小鼠血清抗氧化酶的影響

各組小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量見表2。

表2 OLE 對小鼠血清氧化損傷指標(biāo)的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of OLE on serum oxidative damage in mice（±s，n=6）

表2 OLE 對小鼠血清氧化損傷指標(biāo)的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of OLE on serum oxidative damage in mice（±s，n=6）

注：a表示與正常對照組比較，P<0.05差異顯著；b表示與輻射對照組比較，P<0.05差異顯著。

組別SOD活性/（U/mL）MDA含量/（nmol/mL）GSH-Px活性/（U/mL）正常對照組 135.68±22.85 5.65±0.73 544.76±37.42輻射對照組 73.92±10.29a 15.37±0.82a 383.81±31.89a低劑量組（150 mg/kg） 87.83±5.96a 13.74±0.51a 407.62±47.31a中劑量組（500 mg/kg） 101.27±12.77ab 13.25±0.63ab 441.90±27.73ab高劑量組（1 000 mg/kg） 110.42±16.73ab 10.67±0.40ab 485.71±21.88ab

與正常對照組相比，輻射對照組小鼠血清SOD和GSH-Px活性顯著降低，MDA含量則顯著升高（P<0.05）。與輻射對照組比，中、高劑量OLE組小鼠血清SOD和GSH-Px活性顯著升高，MDA含量明顯下降（P<0.05）。

2.4 OLE對輻射小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響

各組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率見圖2。

圖2 OLE對小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響Fig.2 Effects of OLE on the micronucleus rate of mice

輻射對照組小鼠骨髓細(xì)胞微核率為（2.547±0.491）‰高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。中、高劑量OLE組小鼠的微核率分別為（1.860±0.274）‰，（1.233±0.290）‰，均顯著低于輻射對照組（P<0.05），其中高劑量OLE組的骨髓細(xì)胞微核數(shù)較輻射對照組降低51.59‰。

2.5 OLE對小鼠凋亡蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot電泳圖與各組小鼠蛋白表達(dá)水平見圖 3、圖 4。

圖3 Bcl-2和Bax蛋白Western blot電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis profiles of Bcl-2 and Bax protein

圖4 OLE對小鼠凋亡蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of OLE on expression of apoptotic protein of mice

與輻射對照組相比，高劑量OLE組小鼠Bcl-2表達(dá)水平顯著升高，Bax的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。說明高劑量OLE可有效調(diào)控小鼠肝組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平。

3 結(jié)論與討論

本研究測得橄欖葉中多酚含量為（57.55±2.98）mg/g?？紫榧训萚14]測得橄欖葉中多酚含量為（89.00±1.40）mg/g，高于本研究結(jié)果。而朱靜平[15]發(fā)現(xiàn)卡林等不同品種橄欖葉中的多酚含量約為30.09 mg/g～35.87 mg/g，低于本研究結(jié)果。這可能與橄欖葉的種植區(qū)域、品種等不同有關(guān)。

輻射通過電離或激發(fā)體內(nèi)水分子，產(chǎn)生大量的活性氧自由基，加劇脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)[16]。本研究結(jié)果顯示，輻射可致小鼠血清中的SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA含量增加。給予不同劑量的OLE后，小鼠SOD、GSH-Px活性升高，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減輕，且隨著OLE劑量的增加，這種作用更為顯著。提示橄欖葉酚類物質(zhì)能夠提高機(jī)體的抗氧化能力[17]，減輕輻射造成的氧化損傷。左麗麗等[18]研究發(fā)現(xiàn)，狗棗獼猴桃多酚能夠有效抑制輻射小鼠肝、腎等臟器產(chǎn)生MDA，提高SOD、GSH-Px等酶的活性，減輕機(jī)體輻射氧化損傷，與本文結(jié)果一致。

造血系統(tǒng)是電離輻射最為敏感的系統(tǒng)之一[19]，外周血WBC、RBC、PLT的數(shù)量是反映受到輻射損害的造血干/祖細(xì)胞自我修復(fù)能力的指標(biāo)[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，輻射對照組小鼠外周血細(xì)胞明顯降低，造血干細(xì)胞自我修復(fù)能力減弱，造血功能障礙。中、高劑量OLE組小鼠外周血細(xì)胞數(shù)量則顯著升高，說明OLE能夠減輕輻射造成的小鼠造血系統(tǒng)損傷，促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖分化，其作用機(jī)制可能與多酚能夠降低造血干細(xì)胞內(nèi)ROS水平、恢復(fù)造血系統(tǒng)功能有關(guān)[21]。金飛等[22]也證實(shí)輻射前給予小鼠葡多酚可以促進(jìn)其造血系統(tǒng)恢復(fù)。

輻射容易造成染色體受損斷裂，染色體斷片在細(xì)胞分裂后期仍存留于細(xì)胞質(zhì)中，凝縮形成微核。因此微核率常用來評價DNA的受損情況，以及機(jī)體的修復(fù)能力[23]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OLE能明顯降低輻射小鼠的骨髓細(xì)胞微核率，且隨著OLE劑量的升高，保護(hù)作用增強(qiáng)。這可能與OLE中含有的多酚物質(zhì)能夠有效清除自由基、減輕生物大分子的損傷、阻斷染色體畸變有關(guān)。曹明富[24]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚能夠抑制輻射誘發(fā)細(xì)胞微核形成，具有抗輻射誘變的作用，與本研究結(jié)果相一致。

Bcl-2基因及其相關(guān)蛋白家族可調(diào)控多種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白表達(dá)升高可抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞正常存活；Bax蛋白表達(dá)增加則可加速細(xì)胞凋亡[25]。本實(shí)驗(yàn)中，輻射對照組小鼠抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平升高，而高劑量OLE則可以有效逆轉(zhuǎn)輻照小鼠凋亡蛋白的表達(dá)。提示OLE能夠調(diào)控Bcl-2與Bax蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，減輕輻射誘發(fā)的細(xì)胞損傷。本結(jié)果與山楂多酚提取物可抑制紫外線誘發(fā)HaCaT細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果[26]相一致。

綜上所述，橄欖葉中多酚含量豐富，可有效提高輻射小鼠外周血細(xì)胞數(shù)量，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡，降低DNA損傷，對小鼠的輻射損傷具有良好的防護(hù)作用。