刀豆殼總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

唐森，李璐彬，覃逸明，吳國勇，張鵬 *

（1.廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西 來賓 546199；2.廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室，廣西 來賓 546199；3.廣西科技師范學院科研管理處，廣西 來賓 546199）

刀豆別名為刀鞘豆、葛豆、刀板豆等。因其豆莢很長，其形如刀，顧得其名，是一種雙子葉植物綱薔薇目豆科刀豆屬植物[1]。其喜溫怕冷和強光，對土壤的適應性較好，種植生長周期短，其價格低廉、且營養(yǎng)豐富，因此被廣泛種植。據(jù)記載，該種起源于南美洲，現(xiàn)遍及美國西南部、非洲等地，我國主要集中于廣西、四川、云南、湖北、湖南等地[2]。它是藥食同源的蔬菜，其嫩莢可煮湯、炒食，多作腌制，肉厚鮮美，爽脆可口，且具有溫補作用[3]。湖南省年出口鹽漬刀豆300多噸，暢銷日本、東南亞等地[4]，深受人們喜愛。刀豆中含有多種營養(yǎng)成分如蛋白質(zhì)、纖維素、刀豆氨酸、礦物質(zhì)等，食用后可以滿足人體對能量的需求，可健脾胃，增進食欲，滋補五臟，補充精力。

李寧等[5]對刀豆進行化學分離得到主要藥用成分為尿素酶、血細胞凝集素、刀豆球蛋白、刀豆氨酸、黃酮類成分等。其中刀豆球蛋白是有效抗腫瘤成分，能刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)變成淋巴母細胞，對白血病、鼻咽癌等有明顯的療效[6]。黃酮類化合物具有多方面的功效，可以改善血液循環(huán)、降低膽固醇、抑制炎性生物酶的滲出、強化細胞膜、活化細胞、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤以及增強免疫能力等藥理作用[7]。

目前，國內(nèi)外對刀豆的研究主要集中于刀豆球蛋白成分提取和活性成分分析，但基于研究刀豆總黃酮的提取及其抗氧化活性報道較少[8-10]。孔子銘等[11]采用超聲輔助提取藏藥刀豆總黃酮，得到總黃酮得率為0.675%。牛改改等[12]采用加速溶劑萃取技術(shù)提取海刀豆中總黃酮，提取率高達83.43%。但用微波輔助提取刀豆殼中的總黃酮尚未見報道。

近年來，刀豆殼作為刀豆的廢棄物被農(nóng)民大量的丟棄或焚燒，這樣不僅造成資源浪費，還導致環(huán)境嚴重污染。因此為了提高刀豆殼的利用率，充分發(fā)掘其潛在價值。本試驗將具有提取效率高、快速高效、溶劑消耗少、受熱體系溫度均勻、節(jié)能等優(yōu)點的微波輔助技術(shù)應用于刀豆殼總黃酮的提取[13-15]，并通過響應面法對刀豆殼中總黃酮的工藝條件進行優(yōu)化并研究其抗氧化性，以期為刀豆殼的利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料

刀豆殼：亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司，經(jīng)廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室張鵬博士鑒定為刀豆殼。

1.1.2 供試試劑

蘆丁（超純級）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫（均為分析純）：西隆科學股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

FW135型中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；FA2004B型電子分析天平：上海越平科學儀器有限公司；XH-MC-1型微波合成反應儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水多用真空泵：鞏義市科瑞儀器有限責任公司；C-20型玻璃儀器氣流烘干器：上海貝侖儀器設(shè)備有限公司；UV-9600型紫外/可見分光光度計：北京北分瑞利分析儀器（集團）公司。

1.2 方法

1.2.1 刀豆殼預處理

使用剪刀將塊狀刀豆殼進行適當?shù)募羲椋胖秒姛岷銣毓娘L干燥箱，將儀器的溫度設(shè)置為60℃烘干其水分，用粉碎機粉碎，過60目篩，將刀豆殼粉裝袋密封后常溫保存?zhèn)溆肹16]。

1.2.2 刀豆殼的提取

稱取刀豆殼粉末2.0 g置于三頸燒瓶中，加入一定量的乙醇為提取溶劑，搖勻后用塞子塞住，靜置30min，然后用微波合成反應儀進行提取，最后將提取后的溶液抽濾，取濾液用相同體積分數(shù)的乙醇定容至容量瓶中，即可得刀豆殼提取溶液[17]。

1.2.3 刀豆殼總黃酮提取單因素試驗

1.2.3.1 乙醇體積分數(shù)

準確稱量5份2.0 g預處理后的刀豆殼粉，放置250 mL三頸燒瓶中，分別加入40 mL的不同體積分數(shù)（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇，搖勻，用塞子將其塞住，靜置30 min。設(shè)定微波溫度60℃，微波功率400 W，微波4 min，取出冷卻，抽濾，定容至容量瓶中。測定刀豆殼的總黃酮提取量，做3組重復試驗，找出較佳乙醇體積分數(shù)。

1.2.3.2 液料比

準確稱量5份2.0 g預處理后的刀豆殼粉，放置250 mL 三頸燒瓶中，分別按液料比 11∶1、14∶1、17∶1、20∶1、23∶1（mL/g）加入 50%乙醇搖勻，用塞子將其塞住，靜置30 min。設(shè)定微波溫度60℃，微波功率400 W，微波4 min，取出冷卻，抽濾，定容至容量瓶中。測定刀豆殼的總黃酮提取量，做3組重復試驗，找出較佳液料比。

1.2.3.3 微波時間

準確稱量5份2.0 g預處理后的刀豆殼粉，放置250 mL三頸燒瓶中，分別加入40 mL的50%乙醇搖勻，用塞子將其塞住，靜置30 min。設(shè)定微波溫度60℃，微波功率 400 W，在不同微波時間（2、4、6、8、10 min）微波后取出冷卻，抽濾，定容至容量瓶中。測定刀豆殼的總黃酮提取量，做3組重復試驗，找出較佳微波時間。

1.2.3.4 微波功率

準確稱量5份2.0 g預處理后的刀豆殼粉，放置250 mL三頸燒瓶中，分別加入40 mL的50%乙醇搖勻，用塞子將其塞住，靜置30 min。設(shè)定微波溫度60℃，微波時間 6 min，在不同微波功率（300、400、500、600、700 W）微波后取出冷卻，抽濾，定容至容量瓶中。測定刀豆殼的總黃酮提取量，做3組重復試驗，找出較佳微波功率。

1.2.4 響應面法優(yōu)化試驗

響應面優(yōu)化分析法是利用科學的試驗設(shè)計并進行操作得到相應的數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合響應值與因素之間的函數(shù)關(guān)系，通過對指定設(shè)計空間內(nèi)的樣本點的集合進行有限的試驗設(shè)計，擬合出輸出變量（系統(tǒng)響應）的全局逼近來代替真實響應面[18-19]。

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取最佳乙醇體積分數(shù)（%）、液料比（mL/g）、微波時間（min）、微波功率（W），使用Box-Behnken設(shè)計四因素響應面試驗，試驗因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 response surface test factors and levels

1.3 項目測定

1.3.1 總黃酮提取量的測定

將1.2.2的溶液定容后取2.0 mL于具塞試管中，加入濃度為5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，將其充分搖勻后靜置6 min，再加入濃度為10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，最后再加入濃度為10%氫氧化鈉溶液3.0 mL，搖勻靜置15 min使其充分反應。用可見分光光度計測定其在510 nm波長處的吸光值，按以下公式計算刀豆殼總黃酮的提取量[20]。

式中：C為刀豆殼總黃酮提取液質(zhì)量濃度，mg/mL；V為抽濾后提取液定容的總體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為刀豆殼的質(zhì)量，g。

1.3.2 蘆丁標準曲線制作

參照張曉靜等的方法略微修改[21]。用70%乙醇將0.020 0 g蘆丁配制成0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液，備用。分別移取標準溶液 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 到10 mL的比色管中，加入70%乙醇，使得溶液總體積為2 mL，然后按1.3.1的步驟操作。以70%乙醇為空白，以濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線線性回歸方程：y=13.105x+0.029 3（R2=0.999 1）。

1.3.3 刀豆殼總黃酮抗氧化活性研究

將最佳工藝條件下得到的刀豆殼總黃酮濃縮液加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL 的樣品溶液。參考王彥兵等[22]的方法進行羥自由基清除活性測定，同時以L-抗壞血酸為陽性對照。按照公式計算羥自由基清除率。

式中：A為蒸餾水2 mL+2.5 mmol/L水楊酸溶液2 mL+5.0 mmol/LFeSO4溶液2 mL+5.0 mmol/L H2O2溶液2 mL的吸光度值；A0為樣品溶液2 mL+2.5 mmol/L水楊酸溶液2 mL+5.0 mmol/LFeSO4溶液2 mL+5.0 mmol/L H2O2溶液2 mL的吸光度值；A1為樣品溶液2 mL+2.5 mmol/L水楊酸溶液2 mL+5.0 mmol/L FeSO4溶液2 mL+蒸餾水2 mL的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)重復3次取平均值，采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取量的影響

乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取量的影響見圖1。

由圖1可知，在乙醇體積分數(shù)為40%～50%刀豆殼總黃酮提取量是不斷增大的；在乙醇體積分數(shù)為50%時，刀豆殼總黃酮提取量出現(xiàn)了最大值；在乙醇體積分數(shù)超過50%后提取量逐漸減小。出現(xiàn)這種情況的原因可能是因為刀豆殼粉末和乙醇的滲透壓會根據(jù)乙醇體積分數(shù)的增大而增加，從而有利于總黃酮的浸出[16]，當大于一定限值時，一些醇溶性的其它物質(zhì)大量溶出，導致總黃酮浸出量下降[19]。因而確定提取總黃酮所需乙醇體積分數(shù)為50%，此時總黃酮的提取量為2.146 mg/g。

圖1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction

2.1.2 液料比對總黃酮提取量的影響

液料比對總黃酮提取量的影響見圖2。

圖2 液料比對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on total flavonoid extraction

由圖2可知，隨著液料比的增加，總黃酮提取量先增大后減小，當液料比為20∶1（mL/g）時，總黃酮提取量達到峰值。出現(xiàn)這種情況的原因可能是在一定范圍內(nèi)，液料比的增大可以增強溶劑和原料的接觸效果，增大濃度差，有利于提高擴散速度，從而可提高黃酮類化合物的提取量。但是當乙醇的用量過高時，體系中的其它可溶性物質(zhì)與黃酮競爭溶劑，從而影響總黃酮的提取率[23]。綜合經(jīng)濟效益確定液料比為 20∶1（mL/g）為最佳，此時總黃酮的提取量為2.171 mg/g。

2.1.3 微波時間對總黃酮提取量的影響

微波時間對總黃酮提取量的影響見圖3。

圖3 微波時間對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of microwave time on the extraction of total flavonoids extraction

由圖3可知，在微波時間為2 min～6 min時，刀豆殼總黃酮提取量不斷增大；在微波時間為6 min時出現(xiàn)了最大值；當微波時間超過6 min后，刀豆殼中總黃酮提取量逐漸減小。這可能是因為微波時間過長導致黃酮類物質(zhì)被氧化分解，造成刀豆殼總黃酮提取量下降[19]。因而確定提取總黃酮最適宜微波時間為6 min，此時總黃酮的提取量為2.239 mg/g。

2.1.4 微波功率對總黃酮提取量的影響

微波功率對總黃酮提取量的影響見圖4。

圖4 微波功率對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of microwave power on total flavonoids extraction

由圖4可知，微波功率在300 W～600 W時，刀豆殼中總黃酮提取量逐漸增大；在微波功率為600 W時總黃酮得率達到最大值；之后隨微波功率增大而逐漸下降。出現(xiàn)這種情況的原因可能是在300 W～600 W時微波功率較低，刀豆殼細胞不能被充分的破碎，總黃酮的溶出量較少[24]。因此，確定提取總黃酮的微波功率為600 W，此時總黃酮的提取量為2.352 mg/g。

2.2 響應面法優(yōu)化刀豆殼總黃酮提取工藝

2.2.1 響應面試驗條件與結(jié)果

以乙醇體積分數(shù)（A）、液料比（B）、微波時間（C）、微波功率（D）為自變量，刀豆殼總黃酮提取量（Y）為響應值，設(shè)計四因素三水平試驗，共有29個試驗點，其中24個析因點，5個中心點。試驗設(shè)計的條件及其結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗條件與結(jié)果Table 2 Response surface test conditions and results

使用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計響應面試驗，確定刀豆殼總黃酮最佳提取工藝條件。

得到擬合的回歸方程模型為：Y=2.32+0.020A-0.051B-0.056C+0.056D-0.042AB+0.048AC-0.065AD-0.033BC+0.015BD+0.048CD-0.12A2-0.14B2-0.092C2-0.11D2。

2.2.2 方差分析

響應面回歸方程的方差分析見表3。

表3 響應面回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface regression equation

由4個單因素的F值可知，模型一次項B、C、D與交互項 AD 以及二次項 A2、B2、C2、D2對刀豆殼總黃酮提取量有極顯著的影響（P<0.01）；二次項 AB、AC、CD對刀豆殼總黃酮提取量有顯著的影響（P<0.05）；一次項A與二次項BC、BD對刀豆殼總黃酮提取量影響不顯著（P>0.05）。4個單因素對刀豆殼總黃酮提取量影響程度為：D>C>B>A，微波功率對其影響最大。由表3可知，該模型回歸極顯著（P<0.000 1）；失擬項不顯著（P=0.679 4>0.05），說明該模型可行。模型R2=0.949 2，說明模型擬合度較高，該方法可靠。綜上所述，此模型分析和預測微波輔助提取刀豆殼總黃酮提取量是合理的。

2.3 響應面優(yōu)化圖形分析

響應面圖是由二維等高線圖和三維空間曲面圖組成的，通過擬合出響應面值的形狀，分析各因素對刀豆殼總黃酮提取量的影響[25]。

2.3.1 乙醇體積分數(shù)和液料比的交互作用

在微波時間6 min、微波功率600 W時，乙醇體積分數(shù)和液料比對刀豆殼總黃酮提取量的等高線和響應面見圖5。

由圖5和表3可知，乙醇體積分數(shù)在40%～60%、液料比在 17∶1（mL/g）～23∶1（mL/g）時，刀豆殼總黃酮提取量呈先升高后降低趨勢；液料比曲面較乙醇體積分數(shù)曲面陡峭，說明液料比對刀豆殼總黃酮提取量影響較為明顯。等高線圖呈橢圓形，說明乙醇體積分數(shù)和液料比之間有明顯的交互作用。

圖5 乙醇體積分數(shù)和料液比對總黃酮提取率影響的等高線和響應面曲面Fig.5 Contour lines and response surface of the effects of ethanol volume fraction and liquid- solid ratio on total flavonoids extraction rate

2.3.2 乙醇體積分數(shù)和微波時間的交互作用

當液料比 20∶1（mL/g）、微波功率 600W 時，乙醇體積分數(shù)和微波時間對刀豆殼總黃酮提取量的等高線和響應面見圖6。

圖6 乙醇體積分數(shù)和微波時間對總黃酮提取量影響的等高線和響應面曲面Fig.6 Contour lines and response surface of the effects of ethanol volume fraction and microwave time on total flavonoids extraction rate

由圖6和表3可知，乙醇體積分數(shù)在40%～60%、微波時間在4 min～8 min時，刀豆殼總黃酮提取量呈先升高后降低趨勢；微波時間曲面較乙醇體積分數(shù)曲面陡峭，說明微波時間對刀豆殼總黃酮提取量影響較為明顯。等高線圖呈橢圓形，說明乙醇體積分數(shù)和微波時間之間有明顯的交互作用。

2.3.3 乙醇體積分數(shù)和微波功率的交互作用

當液料比 20∶1（mL/g）、微波時間 6 min 時，乙醇體積分數(shù)和微波功率對刀豆殼總黃酮提取量的等高線和響應面見圖7。

圖7 乙醇體積分數(shù)和微波功率對總黃酮提取量影響的等高線和響應面曲面Fig.7 Contour lines and response surface of the effects of ethanol volume fraction and microwave power on total flavonoids extraction rate

由圖7和表3可知，乙醇體積分數(shù)在40%～60%、微波功率在500 W～700 W時，刀豆殼總黃酮提取量呈先升高后降低趨勢；微波功率曲面較乙醇體積分數(shù)曲面陡峭，說明微波功率對刀豆殼總黃酮提取量影響較為明顯。等高線圖呈橢圓形，說明乙醇體積分數(shù)和微波功率之間有明顯的交互作用。

2.3.4 液料比和微波時間的交互作用

當乙醇體積分數(shù)50%、微波功率600W時，料液比和微波時間對刀豆殼總黃酮提取量的等高線和響應面見圖8。

圖8 液料比和微波時間對總黃酮提取量影響的等高線和響應面曲面Fig.8 Contour lines and response surface of the effects of liquid-solid ratio and microwave time on total flavonoids extraction rate

由圖 8 和表 3 可知，液料比在 17∶1（mL/g）～23∶1（mL/g）、微波時間在 4 min～8 min 時，刀豆殼總黃酮提取量呈先升高后降低趨勢；微波時間曲面較液料比曲面陡峭，說明微波時間對刀豆殼總黃酮提取量影響較為明顯。等高線圖呈圓形，說明料液比和微波時間之間沒有明顯的交互作用。

2.3.5 液料比和微波功率的交互作用

當乙醇體積分數(shù)50%、微波時間6 min時，料液比和微波功率對刀豆殼總黃酮提取量的等高線和響應面見圖9。

圖9 液料比和微波功率對總黃酮提取量影響的等高線和響應面曲面Fig.9 Contour lines and response surface of the effects of liquid-solid ratio and microwave power on the extraction rate of total flavonoids

由圖 9 和表 3 可知，液料比在 17∶1（mL/g）～23∶1（mL/g）、微波功率在500 W～700 W時，刀豆殼總黃酮提取量呈先升高后降低趨勢。等高線圈趨于圓形，3D曲面圖中頂端凸面較為均勻圓潤，其交互作用不顯著。

2.3.6 微波時間和微波功率的交互作用

當乙醇體積分數(shù) 50%、液料比 20：1（mL/g）時，微波時間和微波功率對刀豆殼總黃酮提取量的等高線圖和響應面圖見圖10。

由圖10和表3可知，微波時間在4 min～8 min、微波功率在500 W～700 W時，刀豆殼總黃酮提取量呈先升高后降低趨勢；微波功率曲面較微波時間曲面陡峭，說明微波功率對刀豆殼總黃酮提取量影響較為明顯。等高線圖呈橢圓形，說明料液比和微波功率之間有明顯的交互作用。

圖10 微波時間和微波功率對總黃酮提取量影響的等高線和響應面曲面Fig.10 Contour lines and response surface of the effects of microwave time and microwave power on the extraction rate of total flavonoids

2.4 最優(yōu)工藝參數(shù)的確定

根據(jù)響應面優(yōu)化分析，得到預測刀豆殼總黃酮最大提取量為2.332 mg/g，此時提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù) 50.16%，液料比 19.54∶1（mL/g），微波時間5.56 min，微波功率618.62 W。根據(jù)實際操作調(diào)整為：乙醇體積分數(shù) 50%，液料比 20∶1（mL/g），微波時間5.6 min，微波功率600W，重復試驗3次，得到平均值為2.330 mg/g，與預測值偏差較小，表明該方案是可行的，優(yōu)化后的工藝條件參數(shù)可靠，具有一定參考價值。

2.5 刀豆殼總黃酮抗氧化活性分析

不同質(zhì)量濃度總黃酮提取液、VC對羥自由基清除率影響見圖11。

圖11 不同質(zhì)量濃度總黃酮提取液、VC對羥自由基清除率影響Fig.11 Effects of total flavonoid extract and VCwith different mass concentrations on hydroxyl radical scavenging rate

由圖11可知，刀豆殼總黃酮、VC濃度在0.15mg/mL～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，對羥自由基的清除能力較好。與相同質(zhì)量濃度的VC相比，在質(zhì)量濃度低于0.25 mg/mL時，刀豆殼總黃酮提取液對羥自由基表現(xiàn)出更強的清除能力；質(zhì)量濃度大于0.25 mg/mL時，則VC對羥自由基表現(xiàn)出更強的清除能力[26]。當質(zhì)量濃度為0.50mg/mL，刀豆殼總黃酮提取液達到最大清除率為80.72%，比同質(zhì)量濃度VC的最大清除率97.25%稍弱，但刀豆殼總黃酮也表現(xiàn)出較強的清除羥自由基的能力。

3 結(jié)論

本試驗采用乙醇-微波輔助的方法提取刀豆殼總黃酮，并對其羥自由清除率進行探討。再通過響應面試驗，根據(jù)實際操作得到刀豆殼總黃酮最大提取量為2.330 mg/g，此時提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)50%，液料比 20∶1（mL/g），微波時間 5.6min，微波功率 600 W。羥自由基清除率研究表明，當質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL，刀豆殼總黃酮提取液達到最大清除率為80.72%，比同質(zhì)量濃度VC的最大清除率97.25%稍弱，但刀豆殼總黃酮也表現(xiàn)出較強的清除羥自由基的能力。雖然本試驗刀豆殼總黃酮的提取量較少，但其具有較強的羥自由基清除率，若能得到較好的開發(fā)，將能充分利用刀豆殼資源，提高其利用價值。